Ang Syphilis ay isang nakakahawang sakit na dulot ng spirochete Treponema pallidum, madaling kapitan ng progresibong talamak na kurso, na may malinaw na periodization ng mga klinikal na sintomas.

Ang pangingibabaw ng sexual transmission kaysa sa contact at transplacental transmission ay naglalagay ng sakit na ito sa mga sexually transmitted disease (STDs, STIs). Bilang karagdagan sa mga pamamaraang ito ng paghahatid ng impeksyon, ang isang espesyal na papel ay ginampanan ng artipisyal na ruta (mula sa Latin na "artificio" - artipisyal na nilikha).

Ito ay tipikal para sa mga institusyong medikal, na pangunahing ipinapatupad sa isang setting ng ospital. Nangyayari ang impeksyon sa panahon ng pagsasalin ng dugo, iba't ibang operasyon ng kirurhiko, at mga invasive diagnostic na pamamaraan.

Sa kabila ng quarantine ng naibigay na dugo, ang problema sa pagtukoy ng syphilis sa mga donor sa iba't ibang yugto ng sakit ay may kaugnayan pa rin.

kaya lang mga hakbang sa diagnostic para sa syphilis ay nangangailangan ng standardisasyon, ang pagpapakilala ng mga bagong sensitibo at nagbibigay-kaalaman na pamamaraan ng pagkilala, pati na rin ang pagliit ng mga pagkakamali at maling interpretasyon ng mga resulta ng pagsusulit.

Ipakita lahat

1. Pag-uuri ng mga pamamaraan ng diagnostic sa laboratoryo

Ang diagnosis ng syphilis ay may ilang mga tampok at naiiba sa diagnosis ng iba pang mga impeksyon sa bacterial. Kumplikadong istraktura at ang mga antigenic na katangian ng Treponema pallidum ay nagdudulot ng mga pagkakamali sa interpretasyon ng mga resulta ng serological reactions.

Mayroong 3 pangunahing grupo ng mga pasyente na inaalok ng pagsusuri ng dugo para sa syphilis:

1. 1 Pagsusuri at medikal na pagsusuri ng mga pangkat ng populasyon (kabilang ang pagbubuntis, pagpaparehistro sa klinika ng antenatal, pagtatrabaho at pagpaparehistro ng isang medikal na rekord, at iba pa).
2. 2 Pagsusuri sa mga grupong may panganib (hindi protektadong pakikipagtalik sa isang taong nahawaan ng syphilis, mga taong pagkatapos ng sapilitang pakikipagtalik, mga taong nahawaan ng HIV, at iba pa).
3. 3 Mga taong may sintomas ng sakit o mga taong pinaghihinalaang may impeksyon sa syphilitic.

Ang lahat ng mga pamamaraan sa laboratoryo ay karaniwang nahahati sa direkta at hindi direkta.

1.1. Mga direktang pamamaraan

1. 1 Pagkilala sa Treponema pallidum sa isang madilim na larangan (dark-field microscopy).
2. 2 Impeksyon ng mga pang-eksperimentong hayop (paglilinang sa mga hayop sa laboratoryo).
3. 3 PCR (polymerase chain reaction).
4. 4 DNA probe o hybridization mga nucleic acid.

1.2. Mga hindi direktang pamamaraan

Ang mga serological na reaksyon ay mga pamamaraan mga diagnostic sa laboratoryo, batay sa pagtuklas ng mga antibodies (dinaglat na AT) sa Treponema pallidum antigens (dinaglat na AG). Ang mga ito ay pangunahing kahalagahan para sa pagkumpirma ng diagnosis.

1. 1 Mga pagsubok na hindi treponemal:
   • Reaksyon ng Wasserman (WRS);
   • Ang reaksyon ng microprecipitation (MR, RMP) at ang mga analogue nito, na ibinigay sa ibaba;
   • Rapid plasma reagin test (RPR, RPR);
   • Red Toluidine Serum Test (TRUST);
   • Non-treponemal test ng Venereal Disease Research Laboratory - VDRL.
2. 2 Pagsusuri sa Treponemal:
   • Treponema pallidum immobilization solution – RIBT/RIT;
   • Immunofluorescence solution - RIF, FTA (serum dilutions RIF-10, RIF-200, RIF-abs);
   • R-tion ng passive hemagglutination (RPGA, TRPGA, TPHA);
   • Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA, EIA);
   • Immunoblotting.



Figure 1 - Algorithm para sa serodiagnosis ng syphilis

1.3. Histomorphological na pamamaraan

Ang mga pamamaraang ito ay kumukulo sa pagtukoy ng mga tampok ng histomorphology ng syphilitic manifestations. Ang pansin ay binabayaran sa mga subtleties ng istraktura ng chancre. Gayunpaman, ang differential diagnosis ng impeksyon gamit ang histology ay napakahirap. Ginagamit ang histomorphology kasama ng iba pang mga laboratoryo at klinikal na pagsubok.

2. Dark field microscopy ng Treponema pallidum

Ang pamamaraang ito ay batay sa direktang pagtuklas ng treponema pallidum sa materyal ng pagsubok gamit ang isang mikroskopyo at mga espesyal na aparato (madalas na naglalabas mula sa mga erosions at ulcers, mas madalas na cerebrospinal fluid at iba pang mga substrate).

Ang paggamit ng scarification, scraping, squeezing, exudate ay nakuha mula sa erosions at ulcerative defects, pagkatapos ay ang handa na paghahanda ay sinusuri sa ilalim ng mikroskopyo.

Karaniwan, ang treponema pallidum ay napansin sa isang paghahanda na nakuha mula sa chancre, mula sa foci ng pangalawang sariwa, pangalawang paulit-ulit na syphilis, pati na rin ang punctate ng mga lymph node at inunan.

Batay sa hindi pangkaraniwang bagay ng maliliit na particle na kumikinang sa isang madilim na larangan kapag natamaan ng sinag ng liwanag (Tyndall's phenomenon), ang pamamaraan ay perpektong nagbibigay-daan sa pagkakaiba-iba ng causative agent ng syphilis mula sa iba pang mga treponemes batay sa mga pagkakaiba sa morphological at mga pagkakaiba sa mga mode ng paggalaw ng bakterya.

Para sa mikroskopya, ginagamit ang isang espesyal na dark-field condenser ng naaangkop na optical resolution. Ang gamot ay nakuha sa pamamagitan ng durog na paraan ng drop (isang patak ng materyal ay inilapat sa isang malinis, walang grasa na salamin na slide at tinatakpan ng napakanipis na coverslip).

Ang immersion oil ay ibinabagsak sa cover slip. Sa pamamagitan ng pag-ikot ng tubo at pag-ikot ng magnifying lens, ang nais na pag-iilaw ay nababagay.

Sa madilim na larangan ng isang mikroskopyo, ang mga selula ng dugo ay nakita, epithelial cells at ang causative agent ng syphilis mismo. Ang Treponema pallidum ay mukhang isang spiral, napakanipis, nagpapalabas ng isang kulay-pilak na kulay, na may makinis na paggalaw.



Figure 2 - Dark-field microscopy bilang isang paraan upang mailarawan ang Treponema pallidum sa materyal na pinag-aaralan. Pinagmulan ng paglalarawan - CDC

Ang Treponema pallidum ay dapat na nakikilala mula sa iba pang mga treponema, kabilang ang Tr. refringens, na matatagpuan sa oropharynx at sa mauhog lamad ng mga genital organ. Ang bacterium na ito ay gumagawa ng magulong paggalaw, may malawak at walang simetriko, sa halip magaspang na mga kulot. Bilang karagdagan, ang Treponema pallidum ay nakikilala mula sa Tr. Microdentium, Tr. Buccalis at Tr. vincenti.

Ang visualization ng bacteria sa isang madilim na field ay minsan ay dinadagdagan ng fluorescence reaction. Para sa layuning ito, ang mga antitreponemal antibodies na may label na fluorescent dye ay idinagdag sa katutubong materyal. Sa kasong ito, nabuo ang isang kumplikadong tinatawag na antigen-antibody (pinaikling AG-AT), na siyang bagay para sa pag-aaral gamit ang isang fluorescent microscope.

3. Paraan ng polymerase chain reaction (PCR).

Ang PCR, na binuo noong 1991 upang makita ang molekula ng deoxyribonucleic acid (DNA) ng Treponema pallidum, ay lubos na sensitibo at tiyak, na nagpapahintulot sa pagtuklas ng mga fragment ng DNA ng pathogen.

Batay pagsusuring ito sa pagkopya ng mga maikling seksyon ng DNA ng maputlang spirochete, na nakakatugon sa tinukoy na mga parameter at naroroon sa sample. Ang lahat ng ito ay ginagawa sa ilalim ng mga artipisyal na kondisyon (in vitro). Ang reaksyon ay isinasagawa sa isang aparato - isang thermal cycler, na nagbibigay ng periodization ng mga cycle ng temperatura. Ang paglamig ay nangyayari na sinusundan ng pag-init ng mga test tube na may error na 0.1˚C.

Ang DNA template ay pinainit ng 2 minuto sa temperaturang 92-98˚C (ang pinakamataas na temperatura ay ginagamit kung ang polymerase ay thermostable). Kapag pinainit, naghihiwalay ang mga hibla ng DNA dahil sa pagkasira ng mga bono ng hydrogen sa pagitan nila. Sa hakbang ng pagsusubo, ang temperatura ng reaksyon ay binabawasan upang itali ang primer sa single-stranded na template.

Ang pagsusubo ay tumatagal ng humigit-kumulang 30 segundo, kung saan daan-daang mga nucleotide ang na-synthesize. Ang mga bagong synthesize na molekula ay kinopya ng polymerase, bilang isang resulta kung saan ang mga tiyak na fragment ng deoxyribonucleic acid ay pinarami. Ang kasunod na pagtuklas ng mga fragment ay isinasagawa gamit ang agar gel electrophoresis.

Ang diagnosis ng PCR ng syphilis ay likas na pang-eksperimento, ngunit nabibigyang-katwiran kapag nakita ang isang congenital infection, sa mga kumplikadong diagnostic na kaso, o kapag ang nilalaman ng Treponema pallidum ay minimal sa materyal na pagsubok.

4. DNA hybridization

Ginagawa ang hybridization ng DNA sa vitro at batay sa kumpleto o bahagyang pagsasama ng dalawang single-stranded na molekula ng DNA sa isang molekula. Sa kaso ng kumpletong pagsusulatan ng mga komplementaryong fragment, madali ang pagsasama. Kung ang komplementaryong tugma ay bahagyang, kung gayon ang pagsasama ng mga hibla ng DNA ay nangyayari nang dahan-dahan. Batay sa oras ng chain fusion, maaaring masuri ang antas ng complementarity.

Kapag ang DNA ay pinainit sa isang buffer solution, ang mga hydrogen bond ay nasisira ng mga nitrogenous na base na komplementaryo, na nagiging sanhi ng paghiwalay ng mga chain ng DNA. Susunod, ang isang gamot ay nakuha mula sa dalawang denatured deoxyribonucleic acids. Kapag pinalamig, ang mga single-stranded na rehiyon ay nagiging renatured. Ang tinatawag na DNA hybrid ay nabuo.

Ang pamamaraan ay nagpapahintulot sa iyo na tantyahin at pag-aralan ang rate ng pagsusubo, na isinasaalang-alang ang mga katangian (pagkakatulad at pagkakaiba) ng DNA sa pagitan ng mga species o sa loob ng isang species.

Ang paggamit ng DNA probe ay nagsasangkot ng pag-hybrid ng isang may label na DNA fragment na may partikular na rehiyon ng DNA upang matukoy ang mga pantulong na nucleotide sequence. Ang isang pangkat ng mga unsaturated atoms (chromophores) o radioactive isotopes ay ginagamit upang lagyan ng label ang probe.

Ang DNA probe ay ginagamit para sa heterogenous at homogenous na pagtuklas ng mga nucleic acid. Ang tungkulin ng probe ay tukuyin ang mga lugar kung saan naganap ang target-probe fusion. Ang pagtuklas sa isang homogenous na sistema ay may kalamangan sa pagpapahintulot sa isa na subaybayan ang hybridization ng mga molekula ng DNA sa real time.

Ang kakanyahan ng pamamaraan ay ang DNA denaturation at renaturation (reunification ng DNA chain). Ang proseso ng renaturation ng nucleic acid at DNA probe ay nagtatapos sa pagbuo ng isang "hybrid".

Ang mga partikular na pagkakasunud-sunod ng nucleic acid ay nag-hybrid sa DNA probe at, sa gayon, ay nakita at pinapayagan ang isa na tantyahin ang dami ng DNA sa materyal na pinag-aaralan.

5. Impeksyon ng mga hayop sa laboratoryo

Ang mataas na sensitivity ng mga kuneho sa Treponema pallidum (mga 99.9%) ay nagpapahintulot sa kanila na magamit sa pagsusuri ng impeksyon sa syphilitic.

Ang impeksyon ng mga kuneho ay isinasagawa sa mga sentro ng pananaliksik at ito ang "pamantayan ng ginto" para sa pagtatasa ng sensitivity ng iba pang mga pamamaraan.

Bumalik tayo sa treponemal at non-treponemal test, dahil madalas silang ginagamit. Isaalang-alang natin ang kanilang mga pakinabang at disadvantages, pati na rin ang mga pagkakamali sa pagbibigay-kahulugan sa mga resulta.

6. Mga pagsubok na hindi treponemal

Ito ay mga pagsubok para sa pagtukoy ng IgG at IgM antibodies sa isang standardized cardiolipin antigen. Ang kanilang makabuluhang disbentaha ay ang kanilang medyo mababang pagtitiyak.

Ang mababang gastos at kadalian ng pagpapatupad ay ginagawang posible na uriin ang mga pagsusuring ito bilang mga pagsusuring diagnostic na kinakailangan para sa pagtatatag ng isang paunang pagsusuri at pagsusuri sa populasyon.

Ito ay mga pagsusuring hindi treponemal na ginagawa kapag nag-aaplay para sa isang medikal na rekord, nag-aaplay para sa isang trabaho, o nagrerehistro sa isang klinika ng antenatal.

Bahid:

1. 1 Pinakamababang sensitivity sa yugto ng pangunahing syphilis - 70%;
2. 2 Pinakamababang sensitivity sa yugto ng late syphilis - 30%;
3. 3 Posibilidad ng maling negatibo at maling positibong resulta;
4. 4 Labour intensity ng pagsasagawa ng RSK.

Mga kalamangan:

1. 1 Medyo mababa ang gastos ng paggawa ng pagsubok;
2. 2 Tumanggap ng mabilis na tugon;
3. 3 Posibilidad ng kanilang paggamit para sa screening.

Ang pagkuha ng false-positive o mahinang positibong sample ay posible sa mga sumusunod na kaso:

1. 1 Paglabag sa teknolohiya ng pagpapatupad kapag hinaharangan ang AG-AT complex.
2. 2 Ang pasyente ay may mga sakit na autoimmune (rheumatoid arthritis, rayuma, scleroderma, systemic lupus erythematosus, sarcoidosis, atbp.).
3. 3 Malignant neoplasms.
4. 4 Mga impeksyon sa viral at bacterial.
5. 5 Mga sakit sa endocrine (autoimmune thyroiditis, diabetes mellitus).
6. 6 Pagbubuntis.
7. 7 Pag-inom ng alak.
8. 8 Pagkain ng matatabang pagkain.
9. 9 Senile edad.

Tulad ng nakikita mo mula sa listahan, maraming mga dahilan para sa isang hindi tamang resulta. Samakatuwid, ang isa ay dapat na maging maingat dito. Isaalang-alang natin ang dalawa pang sample kasama ng RSC. Ito ay isang reaksyon ng microprecipitation at VDLR (pagbabago nito).

7. Complement fixation reaction (RSK, Wasserman, RW)

Ito ay isang pagsubok batay sa kakayahan ng pandagdag na magbigkis sa mga AG-AT complex. Natutukoy ang nabuong complex gamit ang hemolytic system. Antigen ng cardiolipin makabuluhang pinatataas ang sensitivity ng sample.

Ang reaksyon ng Kolmer ay sensitibo din, na binubuo ng pagsasagawa nito sa iba't ibang mga kondisyon ng temperatura. Kaya, ang unang yugto ng reaksyon ng Kolmer ay nagpapatuloy sa temperatura na 20˚C sa loob ng kalahating oras, ang pangalawang yugto sa temperatura na 4-8˚C sa loob ng 20 oras. Sa panahong ito, nangyayari ang pag-aayos ng pandagdag.

Kapag nagsasagawa ng RSC, posibleng makakuha ng mga positibong resulta. Ang dahilan ay malamang na isang mataas na titer ng antibodies sa undiluted serum. Sa kasong ito, ang mga sample ay ibinibigay na may pagbaba ng dosis.

Upang maiiba ang mga yugto ng syphilis at masuri ang pagiging epektibo ng anti-syphilitic na paggamot, ang halaga ng AT sa suwero ay tinutukoy.

Ang positivity ng sample ay tinasa gamit ang mga krus, at ang pagbabanto ng serum ay ipinahiwatig din sa mga reaksyon ng Wasserman, Kolmer at Kann.

8. Reaksyon ng microprecipitation

Dahil ang pagiging kumplikado ng pagsasagawa ng mga pagsusuri sa itaas ay mataas, ang isang pinabilis na paraan para sa serodiagnosis ng syphilis, ang tinatawag na express method - reaksyon ng microprecipitation (pinaikling MR, RMP), ay binuo upang masakop ang lawak ng klinikal na pagsusuri ng iba't ibang pangkat ng populasyon .

Ginagawa ito gamit ang cardiolipin antigen at mga pantulong na sangkap. Ang bentahe nito ay ang bakod peripheral na dugo para sa pananaliksik. Ito ay makabuluhang nagpapabilis sa parehong pamamaraan mismo at sa gawain ng mga technician ng laboratoryo.



Figure 2 - Reaksyon ng microprecipitation (scheme)

Upang maisagawa ang MR, ang plasma o hindi aktibo na serum ng dugo ng pasyente ay kinakailangan (naglalaman sila ng mga antibodies). Susunod, ang plasma ay inilalagay sa minarkahang mga balon. Pagkatapos, ang isang patak ng cardiolipin antigen ay idinagdag sa materyal ng pagsubok, halo-halong at inalog. Bilang resulta, lumilitaw ang mga katangian ng mga natuklap sa suwero ng taong nahawahan, na nag-iiba sa intensity.

Ito ay isang kalidad na sample. Para sa quantitative assessment, 10 dilution ng serum ang ginagamit, inilagay sa 10 wells na may naaangkop na label. Sa qualitative MR, ang tugon ay ipinahiwatig sa anyo ng mga krus (pluses) o minus; na may quantitative MR, ang antibody titer ay ipinahiwatig (1:2, 1:4, at iba pa).

Ang pagkakaroon ng mga natuklap ay itinuturing na positibo o mahinang positibong tugon. Ang hitsura ng flocculate ay posible kahit na sa kawalan ng sakit, samakatuwid ang pangwakas na pagtatasa ng resulta na nakuha ay isinasagawa pagkatapos ng isang control study o iba pang mga reaksyon (RIBT, RIF, ELISA, RPGA).

9. VDRL

Ang paraan na inirerekomenda ng World Health Organization para sa pagtatanghal ng isang reaksyon na may isang lipoid antigen (AG) ay nararapat na ituring na pinakamahusay sa iba pang karaniwang mga pagsusuri na hindi treponemal. Binuo sa USA, Georgia sa laboratoryo ng mga sexually transmitted disease (Venereal Diseases Research Laboratories).

Ang pagdadaglat ng institusyon ay nagsilbing pangalan para sa sample - VDRL. Ang VDRL ay isang pagbabago ng MR. Ang serum mula sa isang pasyente na may syphilis ay hindi aktibo at inilagay sa isang glass slide. Ang antigen na ginamit ay binubuo ng cardiolipin, cholesterol at lecithin sa iba't ibang uri porsyento. Ang sagot ay nakarehistro halos kaagad.

Ang kakaibang flocculation ay nangyayari sa pagkakaroon ng mga antibodies sa suwero. Ang serum ay nagiging reaktibo pagkatapos ng 4 na linggo ng impeksyon. Upang masuri ang dami ng antibodies, ang serum ay pre-diluted exponentially.

Mga Bentahe ng VDRL:

1. 1 medyo mataas na sensitivity;
2. 2 medyo mataas na pagtitiyak;
3. 3 kadalian ng pagpapatupad;
4. 4 mababang halaga ng mga reagents;
5. 5 nakakakuha ng mabilis na tugon.

Ang kawalan ng VDRL ay ito ay medyo mataas na dalas maling positibong resulta.

Ang kanilang mga sanhi ay ang parehong mga sakit na nakalista sa itaas.

Ang mga pagsusuri sa Treponemal ay isinasagawa gamit ang mga tiyak na Treponema pallidum antigens. Ang mga ito ay kinakailangan at sapilitan upang magtatag ng pangwakas na diagnosis. Ito ay immunofluorescence reaction (RIF), indirect hemagglutination reaction (IPHA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), atbp.

Pagkatapos ng isang positibong resulta ng isang hindi-treponemal na pagsubok (RPR, MP, VDRL), ang mga pagsusuri sa treponemal ay dapat palaging isagawa (karaniwang kumbinasyon - RPGA, ELISA, RIF).

Ang mga pagsusuri sa treponemal ay mas kumplikadong gawin kaysa sa mga mabilis na pagsusuri at nangangailangan ng mas maraming pera.

10. RIF

Ang reaksyong ito (pinaikling RIF) ay ginagamit upang masuri ang syphilis, kabilang ang mga nakatagong anyo, at i-double-check ang mga positibo at maling positibong sample.

Ang RIF ay batay sa glow ng mga may label na antibodies kapag pinagsama sa isang antigen-antibody complex sa ilalim ng isang quartz lamp. Ang pamamaraan ay nagsimulang gamitin noong 60s at nakikilala sa pamamagitan ng kadalian ng pagpapatupad at mataas na pagtitiyak (na bahagyang mas mababa sa RIBT).

Mayroon itong ilang mga pagbabago: RIF-10, RIF-200 at RIF-abs.

Ang RIF ay pinakasensitibo kapag natunaw ng 10 beses, at ang iba ay mas tiyak. Ang RIF ay isinasagawa sa dalawang yugto. Ang serum ng dugo ng pasyente ay idinagdag sa AG. Ang isang AG-AT complex ay nabuo, na pinag-aralan sa susunod na yugto. Susunod, ang fluorochrome-labeled complex ay kinilala sa pamamagitan ng microscopy. Kung walang glow na naobserbahan, ito ay nagpapahiwatig ng kawalan ng mga tiyak na antibodies sa serum ng dugo.

Ang RIF-200 ay ang pinakamahalaga sa lahat ng dilution. Ang pamamaraan ay inilaan para sa pag-diagnose ng iba't ibang anyo ng syphilis, lalo na ang latent syphilis at muling pagsusuri ng mga positibong sample.

11. RIBT

Ang immobilization reaction ng Treponema pallidum (pinaikling RIBT, RIT) ay isa sa mga kumplikadong serological test na nangangailangan ng malaking pagsisikap at mga gastos sa pananalapi. Ang RIBT ay ginagamit nang mas kaunti, ngunit ang kaugnayan nito ay nananatili sa diagnosis ng latent syphilis.

Ito ay may malaking kahalagahan sa pagkilala sa mga maling positibong resulta sa mga buntis na kababaihan at batay sa immobilization ng bakterya sa pagkakaroon ng mga immobilsin - late antibodies.

Ang resulta ay tinasa batay sa porsyento (%) ng mga immobilized treponemes gamit ang isang espesyal na talahanayan:

1. 1 Mula 0 hanggang 20 - negatibong pagsubok.
2. 2 Mula 21 hanggang 50 - mahinang positibong pagsubok.
3. 3 Mula 50 hanggang 100 - positibong reaksyon.

Posible rin ang mga maling positibong resulta kapag gumagamit ng RIBT. Kaya, ang isang maling sagot ay posible kapag nahawahan ng mga tropikal na trepanematoses, pati na rin sa tuberculosis, cirrhosis ng atay, sarcoidosis at mga pasyente. matandang edad.

12. RPGA

Ang pagsusuring ito ng dugo para sa syphilis ay tinatawag na passive hemagglutination test (dinaglat bilang blood test para sa RPHA, THRHA).

Ang antigen para sa RPHA ay inihanda mula sa mga pulang selula ng dugo ng tupa na pinahiran ng mga fragment ng Treponema pallidum (nakuha mula sa mga nahawaang kuneho (tingnan ang Larawan 4)). Ang pagsusuri ay gumagamit ng venous blood (plasma o inactivated serum) ng pasyente.

Kapag ang isang antigen ay idinagdag sa suwero ng isang pasyente na may syphilis, isang AG-AT complex ay nabuo, na humahantong sa agglutination ng mga pulang selula ng dugo. agglutination ay tinutukoy subjectively sa pamamagitan ng isang laboratoryo technician.



Figure 3 - Scheme ng RPHA (passive hemagglutination reaction)

Ang sample ay tinatasa bilang positibo kapag lumitaw ang mga agglutinate ng isang pare-parehong kulay rosas. Ang pulang paglamlam ng precipitate ay nagpapahiwatig ng pag-ulan ng mga pulang selula ng dugo. Ang RPGA ay lubos na sensitibo at lubos na tiyak.

12.1. Reaksyon ng microhemagglutination

Ito ay isang pinasimpleng bersyon ng RPGA. Naiiba sa pagsubok na inilarawan sa itaas dahil nangangailangan ito ng mas kaunting antigen, diluent, at serum upang maisagawa ang reaksyon. 4 na oras pagkatapos ng incubation ng serum, ang sample ay maaaring masuri. Ginagamit para sa screening at mass examinations para sa syphilis.

13. Enzyme immunoassay

Ang enzyme-linked immunosorbent assay (pinaikling ELISA) ay batay sa isang partikular na reaksyon ng antigen-antibody. Ang biological na materyal (serum ng dugo ng pasyente, cerebrospinal fluid) ay ipinapasok sa mga balon sa solidong ibabaw kung saan naayos ang mga antigen ng treponema pallidum. Ang materyal ng pagsubok ay incubated, pagkatapos ay ang mga antibodies na hindi nakagapos sa mga antigens ay hugasan (tingnan ang Larawan 5).

Ang pagkilala sa nagresultang kumplikado ay isinasagawa sa yugto ng pagbuburo gamit ang immune serum na may label na enzyme. Sa panahon ng isang kemikal na reaksyon, kinukulayan ng enzyme ang mga resultang complex. Ang intensity ng paglamlam ay depende sa dami ng mga tiyak na antibodies sa dugo ng pasyente at naitala ng isang spectrophotometer.



Figure 4 - Scheme ng ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Ang sensitivity ng ELISA ay higit sa 95%. Ang pamamaraan ay ginagamit sa isang automated na mode upang pag-aralan ang mga elektibong pangkat ng populasyon: mga donor, mga buntis na kababaihan at iba pa, upang linawin ang diagnosis ng positibo at maling-positibong mga pagsusuring hindi treponemal.

14. Immunoblotting

Ang immunoblotting ay isang napakasensitibong pamamaraan, isang pagbabago ng simpleng ELISA. Ang reaksyon ay batay sa electrophoresis na may paghihiwalay ng Treponema pallidum antigens.

Ang mga pinaghiwalay na immunodeterminants ay inililipat sa nitrocellulose na papel at binuo sa ELISA. Susunod, ang serum ay incubated at ang mga hindi nakatali na antibodies ay hugasan. Ang resultang materyal ay ginagamot ng mga immunoglobulin (IgM o IgG) na may label na isang enzyme.

15. Klinikal na pagtatasa ng mga resulta ng pagsusuri sa laboratoryo ng syphilis

Sa Talahanayan 1 sa ibaba ay ibinigay namin posibleng resulta pagsusuri at kanilang interpretasyon. Tulad ng makikita mo sa talahanayan, ang isang komprehensibong pagtatasa ng mga pagsusulit ay pangunahing kahalagahan kapag nagde-decipher.



Talahanayan 1 - Interpretasyon ng mga resulta ng serological reactions (mga pagsusuri sa dugo para sa syphilis). Upang tingnan, mag-click sa talahanayan

Sinusuri din ang reaktibidad ng pagsubok gamit ang "mga krus":

1. 1 Ang pinakamataas na tugon (sharply positive test) ay ipinahiwatig ng 4 na krus.
2. 2 Ang isang positibong pagsusuri ay ipinahiwatig ng 3 mga krus.
3. 3 Ang mahinang positibong reaksyon ay ipinahihiwatig ng dalawang krus.
4. 4 Ang isang krus ay nagpapahiwatig ng kahina-hinala at negatibong resulta.
5. 5 Ang negatibong sagot ay minarkahan ng minus sign.

Ang problema ng pag-optimize ng mga diagnostic ng laboratoryo ng syphilis ay hindi nawala ang kaugnayan nito hanggang sa araw na ito. Ang mga modernong pamamaraan ng diagnostic, sa kabila ng pagnanais ng mga siyentipiko na dalhin ang mga diagnostic sa pinakamataas na posibleng antas ng sensitivity at specificity, ay nangangailangan ng control testing at isang indibidwal na diskarte.

Ang isang tampok ng impeksyon sa syphilitic ay ang kababalaghan ng seroresistance, na hindi pa nakatanggap ng siyentipikong paliwanag. Ang diagnosis ay ginawa pagkatapos ng buong pagsusuri ng pasyente gamit ang mga pamamaraan ng epidemiological, klinikal, at laboratoryo.

Laban sa backdrop ng pang-ekonomiya at teknikal na pag-unlad ng medisina, ang pag-unlad ay sinusunod din sa pagbuo ng mga bagong pamantayan para sa pag-diagnose ng syphilis. Ang lahat ng ito ay magpapahintulot sa iyo na mabilis, matagumpay at tumpak na gamutin ang mga pasyente.

Mga pagsusuri sa treponemal para sa syphilis. Pangkalahatang paglalarawan.

Upang mapagkakatiwalaang masuri ang syphilis at makilala ang mga anti-syphilitic antibodies sa katawan ng pasyente (sa serum ng dugo o cerebrospinal fluid), ginagamit ang mga espesyal na teknolohiya sa pananaliksik sa laboratoryo - ang tinatawag na mga pamamaraan ng serological.

Kapag nagsasagawa ng mga diagnostic test para sa syphilis, ginagamit ang iba't ibang serological reactions: agglutination, precipitation, immunofluorescence, complement fixation, enzyme-linked immunosorbent assay, atbp. Ang lahat ng mga serological reaction na ito ay batay sa pakikipag-ugnayan ng mga antigens at antibodies.

Ang mga tiyak na pagsusuri sa serological ay tinatawag treponemal dahil ang mga pagsubok na ito ay gumagamit ng Treponema pallidum o ang kanilang mga antigen, iyon ay, mga antigen na pinanggalingan ng treponemal. Ang layunin ng mga pagsusuri sa treponemal ay upang matukoy ang mga partikular na antibodies sa mga antigenic na istruktura ng causative agent ng syphilis, iyon ay, mga antibodies na partikular na nakadirekta laban sa T. Pallidum bacteria mismo, at hindi laban sa mga tisyu ng katawan na nasira ng treponema. Ang mga partikular na anti-treponemal antibodies ng klase ng IgM ay maaaring matukoy na sa pagtatapos ng ikalawang linggo ng sakit.

7. Maling positibo at maling negatibong resulta

Ang mga positibong resulta ng RV para sa syphilis sa mga indibidwal na hindi nagdurusa sa sakit na ito ay tinatawag na mga maling positibo. Ang rate ng maling positibong resulta sa mga malulusog na indibidwal ay 0.2-0.25%. Kung ang porsyento ng hindi tiyak na maling-positibong RT ay nagreresulta sa malulusog na tao ay napakaliit, kung gayon sa ilang mga sakit maaari itong maging mataas.

Ang lahat ng hindi tiyak na mga resulta ng serological reaksyon ay maaaring nahahati sa mga sumusunod na pangunahing grupo:

1. Mga sakit na sanhi ng pagkakaroon ng mga karaniwang antigen sa mga katulad na pathogens (spirochetes): umuulit na lagnat, yaws, bejel, pinta, oral treponema, leptospira.

2. Mga positibong reaksyon na dulot ng mga pagbabago sa metabolismo ng lipid at mga pagbabago sa serum globulin. Kabilang dito ang mga positibong resulta sa mga buntis na kababaihan, mga pasyente na may gota, mga lipid disorder bilang resulta ng pagkalason na may lead, phosphorus, pagkatapos kumuha ng sodium salicylate, digitalis, atbp. Ang mga reaksyong ito ay dapat ding magsama ng mga positibong reaksyon sa ilang mga nakakahawang sakit (typhus, malaria, pneumonia , ketong, endocarditis, collagenosis, myocardial infarction, concussion, cancer, liver cirrhosis, atbp.)

3. Mga teknikal na pagkakamali. Maling pagpili ng pandagdag na dosis, hindi pagsunod sa mga kondisyon at panahon ng pag-iimbak ng mga reagents, pagbubukod ng control blood serum sample mula sa pagsusuri, paggamit ng mga kontaminadong test tube at instrumento.

8. Pagbabago ng reaksyon ng Wasserman

May mga pagbabago sa reaksyon ng Wasserman sa qualitative at quantitative na mga bersyon, sa malamig, na may cerebrospinal fluid.

Pagbabago ng RV sa lamig naging mas sensitive. Ang isang espesyal na tampok ng paraan ng pagtatanghal ng reaksyon ng Wasserman sa malamig ay ang tatlong-phase na mga rehimen ng temperatura kung saan nangyayari ang pag-aayos ng pandagdag. Ang reaksyong ito ay ginagawa din sa cardiolipin at treponemal antigen.

Bilang karagdagan sa pagtatasa ng husay ng RF, mayroong isang paraan para dito quantitative na pahayag na may iba't ibang dilution ng serum ng dugo (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Ang reagin titer ay tinutukoy ng pinakamataas na dilution na nagbibigay pa rin ng isang positibong resulta (4+). Ang quantitative staging ng RV ay mahalaga sa pagsusuri ng ilang uri ng syphilis at sa pagsubaybay sa pagiging epektibo ng therapy.

9. Saklaw ng aplikasyon

Sa Russia, ang RSKt ay bahagi ng isang hanay ng mga karaniwang serological na pagsusuri para sa syphilis (SSR).

Ang reaksyon ng Wasserman na may treponemal at cardiolipin antigen (RSKt) ay ginagamit para sa

• diagnosis ng lahat ng anyo ng syphilis,
• pagsubaybay sa pagiging epektibo ng paggamot,
• pagsusuri ng mga taong nakipagtalik sa isang pasyenteng may syphilis,
• pagsusuri ng mga taong may klinikal at anamnestic na hinala ng syphilis
• sa panahon ng preventive examination para sa syphilis ng mga pasyente sa psychiatric at neurological na mga ospital, mga donor at mga buntis na kababaihan, kabilang ang mga taong ipinadala para sa pagpapalaglag.

Sa kasalukuyan, sa pamamagitan ng utos ng Ministry of Health ng Russian Federation, inirerekumenda na palitan ang RSCT ng mas sensitibong mga pamamaraan ng treponemal (ELISA o RPGA).

Sa ibang bansa, ang reaksyon ng Wasserman na may treponemal antigen ay hindi ginagamit sa klinikal na kasanayan sa laboratoryo sa loob ng mahabang panahon at hindi kasama sa listahan ng mga karaniwang pagsusuri na inirerekomenda ng World Health Organization.

Kumplikado ng mga classical serological reactions (CSR)

KSR- Ito kumplikado ng mga reaksyon, ginagamit para sa serodiagnosis ng syphilis bilang karaniwang pamamaraan. Kasama sa kumplikadong mga reaksyon na ito ang reaksyon ng Wassermann na may cardiolipin antigen (isang katas mula sa puso ng baka na pinayaman ng lecithin at kolesterol) at treponemal antigen (isang ultrasonic-treated na suspensyon ng apathogenic cultured treponemes pallidum), pati na rin ang microprecipitation reaction (MPR) na may plasma o inactivated serum, na inilalagay sa cardiolipin antigen

Nagiging positibo ang mga CSR sa gitna ng pangunahing panahon (ang paghahati nito sa seronegative at seropositive ay tiyak na tinutukoy ng CSR), sa pangalawang panahon ang mga CSR ay positibo sa 98-100% ng mga pasyente, at sa tertiary period - lamang sa 60-70%. Ibig sabihin, habang tumataas ang tagal ng sakit, unti-unting bumababa ang positivity ng CSR.

Mga kalamangan ng DAC:

1) Mura, simple at bilis ng pag-install. Ito ay totoo lalo na para sa reaksyon ng microprecipitation: Ang RMP ay kasalukuyang pangunahing pamamaraan ng screening (pagpili);

2) Ang mga non-treponemal na pagsusuri ay maginhawang gamitin upang subaybayan ang lunas ng syphilis.

Mga disadvantages ng DAC:

1) Subjectivity sa pagtatasa ng mga resulta ng mga reaksyon ("sa pamamagitan ng mata");

2) Mababang sensitivity sa mga huling anyo ng syphilis;

3) Kakulangan ng pagtitiyak kumpara sa mas modernong mga pagsubok. Kapag isinagawa ang mga ito, madalas na nakikita ang mga maling positibong reaksyon (FPR).

Ang LPR ay maaaring sanhi ng cross-reactivity sa pagitan ng pallid spirochete at iba pang microbes, mga karamdaman sa metabolismo ng lipid at protina, kawalang-tatag mga lamad ng cell, pagbuo ng mga autoantibodies. Ang mga LPR ay sinusunod sa acute (malaria, infectious mononucleosis, atbp.) at talamak (tuberculosis, leprosy, hepatitis, borreliosis, atbp.) na mga impeksyon, myocardial infarction, liver cirrhosis, collagenosis (lalo na sa SLE), oncopathology, pagbabakuna, paggamit ng droga, pag-abuso sa alkohol at mataba na pagkain. Ang mga maling positibo ay maaaring mangyari sa mga huling linggo ng pagbubuntis, pagkatapos ng panganganak, at sa ilang kababaihan, sa panahon ng regla. Ang mga maling-negatibong resulta ng DSC ay maaaring nauugnay sa impeksyon sa HIV.

RIT, RIBT - Treponema pallidum immobilization reaksyon

Ang Treponema pallidum immobilization test (TPI) ay isang klasikong pamamaraan na ginagamit upang makita ang mga partikular na treponemal antibodies. Ang reaksyon ng RIBT ay gumagamit ng pathogenic na Treponema pallidum T. pallidum (Nichols strain) na lumago sa isang rabbit testicle bilang isang antigen. Ang RIBT ay batay sa pagkawala ng motility ng nabubuhay na Treponema pallidum pagkatapos ng pagkakalantad sa mga antibodies mula sa serum ng dugo at pandagdag ng pasyente. Ang mga resulta ay tinasa gamit ang dark-field microscopy. Bagama't ang pagsusulit ng RIBT ay ipinakilala sa klinikal na kasanayan bilang isang partikular na pagsusuri para sa syphilis, ito ay labor-intensive, teknikal na kumplikado, nakakaubos ng oras at mahal na gamitin.

1. Kasaysayan ng paraan ng RIBT

Ang Treponema pallidum immobilization test (TPI) ay talagang ang unang partikular na pagsubok para sa pag-diagnose ng syphilis. Ang reaksyong ito ay ipinakilala noong 1949 ng mga Amerikanong mananaliksik na sina R. W. Nelson at M. M. Mayer at tinalakay nang detalyado sa mga akdang siyentipiko sa mga sumunod na dekada. Ang mga hindi matagumpay na pagtatangka na gumamit ng mga live na treponeme sa mga pagsubok ay nagawa na dati. Salamat sa katotohanang nakagawa si Nelson ng isang kapaligiran kung saan nanatiling mabubuhay ang mga treponemes hanggang 8 araw, naging matagumpay ang kanyang pananaliksik.

2. Ang prinsipyo ng paraan ng RIBT

Ang pamamaraan ay batay sa kababalaghan ng pagkawala ng motility ng treponema pallidums sa pagkakaroon ng immobilizing antitreponemal antibodies ng test blood serum at umakma sa ilalim ng anaerobic na kondisyon. Ang antigen ay live pathogenic na Treponema pallidum na nakuha mula sa mga kuneho na artipisyal na nahawaan ng syphilis.

3. Pagse-set up ng RIBT test

Ang reaksyon ay kinabibilangan ng test serum, complement at antigen. Ang serum ng dugo ng paksa ay idinagdag sa live na treponema na nakuha mula sa testicular tissue ng kuneho pagkatapos ng artipisyal na impeksiyon. Sa pagkakaroon ng mga anti-treponemal antibodies-immobilins sa suwero, ang treponema pallidums ay huminto sa paggalaw (immobilized). Ang mga immobilisin antibodies ay mga late antitreponemal antibodies.

Ang reaksyon ay isinasagawa gamit ang heat-inactivated sera o may mga sample ng sera na pinatuyo sa wax paper (dry drops). Ang inactivation ng serum sa pamamagitan ng pag-init ay isinasagawa sa loob ng 30 minuto sa temperatura na 56°C. Bago kumuha ng dugo, ang paksa ay hindi dapat tumanggap ng mga gamot, lalo na ang penicillin. Ang pag-inom ng mga gamot ay itinigil sa panahon ng posibleng pagpapanatili nito sa katawan.

Ang Nichols strain bacteria na nakuha mula sa 7–10-araw na rabbit na syphilitic orchitis (pamamaga ng testicle) ay ginagamit bilang isang antigen. Ang panahon mula sa sandali ng pag-set up ng reaksyon hanggang sa pagtatala ng mga resulta nito ay tumatagal ng 18-20 oras, samakatuwid, ang isang kapaligiran ng kaligtasan ay kinakailangan upang mapanatili ang posibilidad at mahusay na kadaliang mapakilos ng mga microorganism.

Gumagamit ang RIBT ng guinea pig complement. Upang makakuha ng pandagdag, ang dugo ay dapat kunin sa ilalim ng mga sterile na kondisyon mula sa ilang guinea pig.

Sa kaso ng bacterial contamination, ang pandagdag ay tinanggihan. Ang de-latang pandagdag ay hindi maaaring gamitin sa immobilization reaction ng Treponema pallidum, dahil ito ay nakakalason sa mga mikroorganismo.

Ang reaksyon ng immobilization ay gumagamit ng labis na pandagdag. Ang dami nito ay higit na nakadepende sa survival environment para sa Treponema pallidum.

Ang RIBT ay inilalagay sa mga sterile na kahon, pre-irradiated na may bactericidal quartz lamp sa loob ng 45-60 minuto. Ang bawat serum ng dugo ay sinusuri sa dalawang test tubes: naranasan At kontrol. Ang test serum at antigen ay idinagdag sa parehong mga tubo sa kinakailangang dami. Ang aktibong pandagdag ay ibinubuhos sa test tube, at ang parehong halaga ng hindi aktibo na guinea pig blood serum sa control tube. Pagkatapos ng pagpuno, ang mga nilalaman ng mga tubo ay halo-halong sa pamamagitan ng banayad na pag-alog.

Ang RIBT ay nangyayari sa ilalim ng anaerobic na kondisyon. Ang mga test tube na may mga sangkap ay inilalagay sa isang microanaerostat, kung saan sinisipsip ang hangin sa atmospera gamit ang isang vacuum pump at ang isang halo ng gas ay pumped mula sa isang silindro (95 bahagi ng nitrogen at 5 bahagi ng carbon dioxide). Ang microanaerostat na may mga test tube ay inilalagay sa isang thermostat (35°C) sa loob ng 18-20 oras.

Ang mga resulta ng RIBT ay tinasa pagkatapos alisin ang mga tubo mula sa thermostat at microanaerostat (ibig sabihin, pagkatapos ng 18-20 oras ng eksperimento). Gamit ang isang Pasteur pipette, ang isang patak ng mga nilalaman ng test tube ay inilapat sa isang glass slide, na natatakpan ng isang coverslip at sinusuri sa isang dark field microscope (layunin 40, eyepiece 10X). Sinusuri ang ilang larangan ng pagtingin sa iba't ibang bahagi ng paghahanda, binibilang ang bilang ng mga mobile at immobile na treponemes pallidum sa bawat isa. Ang pagbibilang ay nagsisimula sa gamot mula sa control at pagkatapos ay mula sa test tube.

Kapag nagse-set up ng reaksyon, 5 control study ang ginagamit: na may malinaw na positibo at negatibong blood sera, na may aktibo at hindi aktibo na complement at survival medium para sa Treponema pallidum. Ang control negative blood serum ay ginagamit upang hatulan ang antas ng motility ng Treponema pallidum sa eksperimentong ito. Kontrolin ang positibong serum ng dugo - upang masuri ang antas ng aktibidad ng immobilizing sa ilalim ng mga kondisyon ng eksperimentong ito. Ang isang pag-aaral ng aktibo at hindi aktibo na pandagdag at ang kapaligiran ay isinasagawa upang matukoy ang kanilang epekto sa motility ng Treponema pallidum.

Kung may kakulangan ng pandagdag sa eksperimento, ang mga immobilizing antibodies ay hindi nagpapakita ng kanilang aktibidad nang maayos at ang mga treponemes ay nananatiling mobile. Samakatuwid, pagkatapos ng eksperimento, ang natitirang pandagdag ay tinutukoy upang masuri kung ang motility ng Treponema pallidum sa mga test tube ay dahil sa kakulangan ng pandagdag. Para sa layuning ito, ginagamit ang isang hemolytic system - isang halo ng isang suspensyon ng mga erythrocytes ng tupa at diluted hemolytic serum na itinatago sa isang termostat.

Natutukoy ang natitirang pandagdag sa pamamagitan ng pagdaragdag ng kinakailangang dami ng hemolytic system sa bawat tubo. Ang mga tubo ay inilalagay sa isang termostat sa 37° sa loob ng 45 minuto. Sa mga test tube, dapat mangyari ang hemolysis ng mga pulang selula ng dugo, sa mga control tube ay dapat magkaroon ng pagkaantala sa hemolysis. Ang kawalan ng hemolysis sa mga tubo ng pagsubok ay nagpapahiwatig ng hindi sapat na dami ng pandagdag; sa mga kasong ito, dapat na ulitin ang pag-aaral. Ang paulit-ulit na pagsusuri sa serum ng dugo ay hindi ginagawa lamang kung ang 100% immobilization ng Treponema pallidum ay nabanggit.

4. Accounting para sa mga resulta ng RIBT

Ang pagbibilang ng mga immobilized treponema na nawalan ng kadaliang kumilos ay isinasagawa sa ilalim ng mikroskopyo gamit ang dark-field microscopy method. Ang mananaliksik ay kinakailangang magkaroon ng kasanayan sa pagtatasa ng paggalaw ng mga treponemes. Dapat niyang bigyang-pansin ang intensity ng mga paggalaw na ginawa ng Treponema pallidum. Sa bacterium na ito ay hindi laging posible na obserbahan ang parang alon na mga contraction at flexion na paggalaw, minsan ay umiikot lamang. Dapat mo ring makilala ang mga aktibong paggalaw ng treponemes mula sa paggalaw na may daloy ng likido.

Upang masuri ang mga resulta ng reaksyon, kinakalkula ang porsyento ng immobilization ng maputlang treponema, i.e. ang ratio ng mga mobile at immobile na treponema sa eksperimento (na may aktibong pandagdag) at kontrol (na may hindi aktibong pandagdag) ayon sa formula:

X = (M – C)×100/M

kung saan ang M ay ang bilang ng mga mobile treponemes sa kontrol; Ang C ay ang bilang ng mga mobile treponeme sa eksperimento; X - % immobilization. SA Praktikal na trabaho ang porsyento ng immobilization ay tinutukoy mula sa isang pre-compiled na talahanayan gamit ang formula sa itaas.

Ang reaksyon ng immobilization ng Treponema pallidum ay tinasa bilang

• positibo sa panahon ng immobilization 51 - 100% Treponema,
• mahinang positibo: 31 - 50% hindi kumikibo na mga treponema,
• nagdududa: 21 - 30% hindi kumikibo na mga treponema,
• negatibo: 0 - 20% hindi kumikibo na mga treponema.

Ang reaksyon ng immobilization ng Treponema pallidum ay nagiging positibo sa pagtatapos ng pangunahing - simula ng pangalawang panahon ng syphilis (mula sa ika-7-8 na linggo mula sa sandali ng impeksyon o higit pa). Gayunpaman, ang RIBT ay hindi gaanong ginagamit para sa pag-diagnose ng mga maagang yugto ng syphilis, dahil ang mga antibodies na nagpapatigil sa Treponema pallidum at natukoy sa reaksyon ay lilitaw lamang 3-6 na linggo pagkatapos ng impeksiyon. Ang mga immobilisin antibodies ay kabilang sa klase ng IgG ng mga immunoglobulin. Lumilitaw ang mga ito sa dugo mamaya kaysa sa mga reagin (anticardiolipin antibodies), mamaya kaysa sa fluorescein antibodies (natukoy ng RIF at ELISA) at precipitin (natukoy ng kanser sa pantog).

Sa hinaharap, ang RIBT ay nananatiling positibo. Mayroong mataas na sensitivity ng reaksyon sa mga huling anyo ng syphilis. Sa kaso ng pangalawang, late syphilis, neurosyphilis, congenital syphilis, ang isang positibong resulta ng RIBT ay naitala sa 95-100% ng mga kaso. Sa tertiary syphilis, na may mga tiyak na sugat ng mga panloob na organo, sistema ng nerbiyos, kapag ang RV ay madalas na negatibo, ang RIBT ay nagbibigay ng mga positibong resulta sa 98 - 100% ng mga kaso.

Ang RIBT ay matagal nang kinikilala bilang ang pinaka-espesipikong pagsusuri para sa syphilis. Ayon sa panitikan, ang pagtitiyak ng RIBT ay 99%, ang sensitivity ay mula 79 hanggang 94%. Ayon sa TsNIKVI, ang sensitivity ng RIBT (sa kabuuan, para sa lahat ng mga yugto ng syphilis) ay 87.7%.

7. Saklaw ng aplikasyon ng pamamaraan

Ang saklaw ng aplikasyon ng RIBT ay unti-unting lumiliit dahil sa tagal ng pag-install, mataas na gastos at intensity ng paggawa. Ang RIBT ay isang medyo kumplikado at magastos na pagsusuri na nangangailangan ng mataas na kwalipikadong tauhan at pagkakaroon ng isang vivarium. Kaugnay nito, ang paggamit ng pamamaraang ito ay nabawasan nang malaki sa mga nakaraang taon. Sa US, ang pagsusulit na ito ay kasalukuyang ginagamit lamang sa mga laboratoryo ng pananaliksik.

Batay sa pagiging kumplikado at mataas na halaga ng RIF at RIBT, makatuwirang gamitin ang mga ito upang masuri ang mga late at latent na anyo ng syphilis. Napanatili ng RIBT ang posisyon nito bilang isang "arbiter ng reaksyon" sa differential diagnosis ng mga maagang nakatagong anyo ng syphilis at mga false-positive na resulta. Ang reaksyong ito ay maaaring maging kapaki-pakinabang sa pag-diagnose ng neurosyphilis at kapag ang mga resulta ng iba pang mga serological na pagsusuri ay hindi magkatugma.

Ang RIBT ay nagiging positibo sa ibang pagkakataon kaysa sa RIF at RV. Samakatuwid, hindi ito ginagamit upang masuri ang mga nakakahawang anyo ng syphilis.

Ang RIBT, tulad ng RIF, ay napakabagal na negatibo sa panahon ng antisyphilitic therapy. Bilang isang resulta, ito ay hindi angkop para sa pagsubaybay sa pag-unlad ng antisyphilitic therapy.

Ang mga maling positibong resulta (FPR) na may RIBT ay bihira at nabanggit pangunahin sa isang bilang ng mga treponematoses (yaws, pinta, bejel), na hindi matatagpuan sa Russia, gayundin sa ketong, sarcoidosis, SLE, tuberculosis, cirrhosis ng atay at ilang iba pang bihirang sakit na hindi syphilitic. Habang tumatanda ang mga pasyente, tumataas ang bilang ng mga false-positive na resulta ng RIBT.

Maaaring false positive ang RIBT kung ang test serum ay naglalaman ng mga treponemocidal substance (halimbawa, penicillins, tetracyclines, erythromycin), na nagdudulot ng hindi tiyak na immobilization ng Treponema pallidum. Ito ay maaaring resulta ng pag-inom ng pasyente ng treponemocidal antibiotics, kaya hindi isinagawa ang pagsusuri para sa mga taong nakatanggap ng antibiotic sa loob ng nakaraang buwan. Ang dugo para sa RIBT ay maaaring masuri nang hindi mas maaga kaysa sa 2 linggo pagkatapos ng pag-inom ng mga antibiotic at iba pang antisyphilitic na gamot.

9. Mga pagbabago sa immobilization reaction ng Treponema pallidum

Bilang karagdagan sa pamamaraan ng microanaerostat, mayroong isang melange na pamamaraan ng RIBT ayon sa N.M. Ovchinnikov. Ang mga anaerobic na kondisyon kapag nagse-set up ng isang reaksyon ay nilikha sa pamamagitan ng paglalagay ng reacting mixture sa isang melanger (leukocyte mixer), ang magkabilang dulo nito ay sarado na may rubber ring. Ang melange reaction technique ay nagpapahintulot sa iyo na gawin nang walang vacuum pump, isang silindro na may pinaghalong nitrogen at carbon dioxide, o isang microanaerostat. Ang isang paghahambing na pag-aaral sa isang malaking klinikal na materyal ay nagbunga ng mga resulta na hindi mas mababa sa klasikal na anaerostatic na pamamaraan.

10. Mga tampok, pakinabang at disadvantages ng RIBT

Ang RIBT ay isang teknikal na kumplikado at mahal na paraan ng diagnostic. Ang teknolohiya ay nangangailangan ng malaking pondo para sa pag-iingat ng mga kuneho at pagsasagawa ng pagsubok. Ang labor-intensive na pagsubok na ito ay kasalukuyang ginagamit pangunahin para sa mga layuning pang-agham. Sa karamihan ibang bansa Sa loob ng halos 40 taon, ang RIBT ay halos ginagamit hindi para sa mga layuning diagnostic, ngunit sa gawaing pananaliksik lamang.

Mga disadvantages ng reaksyon:

• Ang RIBT ay nangangailangan ng pagtatrabaho sa live pathogenic Treponema pallidum ng Nichols strain, na nananatiling nakakahawa sa mga tao sa kabila ng pagbagay sa mga kuneho
• ang pagtatanghal ng reaksyon ay kumplikado, matagal at mahal
• kailangan ng vivarium
• ang mga highly qualified na tauhan ay kinakailangan upang i-set up ang reaksyon, itala ang mga resulta at mapanatili ang vivarium
• pagiging subjectivity ng pagtatasa ng mga resulta
• kakulangan ng automation
• hindi posibleng i-standardize ang serological method na ito.
• ang reaksyon ay hindi naaangkop laban sa background ng patuloy na antisyphilitic therapy
• kawalan ng kakayahang gamitin upang kontrolin ang lunas. Ang RIBT sa mga pasyenteng may syphilis ay maaaring manatiling positibo sa loob ng maraming taon (at kahit habang buhay), sa kabila ng pagtanggap ng buong paggamot.
• ang reaksyon ay maaaring magbigay ng maling positibong resulta sa mga pasyenteng may malignant na tumor, diabetes, ketong, mga sakit sa autoimmune, pulmonya, at malubhang cardiovascular pathology.

Ang mga pakinabang ng RIBT ay:

1) Sapat na mataas na sensitivity;

2) Mataas na pagtitiyak.

RIF (Immunofluorescence reaction)

Ang immunofluorescence reaction (RIF) ay isang mabilis na paraan ng diagnostic para sa pagtukoy ng mga microbial antigens o pagtukoy ng mga antibodies. Ang mga pagsusuri batay sa pagtuklas ng fluorescent signal ay itinuturing na isa sa mga pinakamahusay na pagsusuri para sa syphilis.

1. Kasaysayan ng pamamaraan

Ang fluorescent treponemal antibody (FTA) test ay unang binuo noong 1957 ng Deacon at mga co-authors (Deacon, Falcone at Harris).

2. Prinsipyo ng pamamaraan

Ang paraan ng RIF ay batay sa katotohanan na ang mga tissue antigens o microbes na ginagamot sa immune sera na may mga antibodies na may label na mga fluorochrome ay maaaring kumikinang sa mga sinag ng UV ng isang fluorescent microscope. Ang mga bakterya sa isang pahid na ginagamot na may tulad na luminescent na serum na glow sa paligid ng cell sa anyo ng isang berdeng hangganan

Bilang isang antigen sa RIF, ginagamit ang isang suspensyon ng live pathogenic pallid Treponema strain Nichols mula sa rabbit orchitis, na pinatuyo sa isang glass slide at naayos na may acetone. Ang serum ng dugo ng pasyente ay idinagdag sa Treponema pallidum, pinatuyo at naayos sa baso na may acetone.

Pagkatapos ng paghuhugas, ang gamot ay ginagamot ng serum na naglalaman ng mga antibodies laban sa mga immunoglobulin ng tao na may label na fluorescein. Ang paghahanda ay hugasan muli at sinusuri sa ilalim ng isang fluorescent microscope. Kung ang test serum ay naglalaman ng anti-treponemal fluorescein antibodies, isang dilaw-berdeng glow ng mga treponemes ay mapapansin.

3. Paraan ng pagsasagawa ng pananaliksik gamit ang RIF method

Ang antigen na naayos sa isang glass slide (pathogenic Treponema pallidum) ay ginagamot sa test serum. Pagkatapos ng paghuhugas, ang gamot ay ginagamot ng fluorescent serum laban sa mga immunoglobulin ng tao, na may label na fluorochrome. Sa kasong ito, ang nagreresultang fluorescent complex (anti-human globulin + fluorescein thioisocyanate) ay nagbubuklod sa human globulin sa ibabaw ng treponema pallidum, na tinitiyak ang glow ng treponema pallidum sa ilalim ng fluorescent microscope.

Upang makita ang mga antigen-antibody complex, isang luminescent serum na kumakatawan sa mga anti-species (anti-human) immunoglobulin na pinagsama sa FITC. Ang pagkakaroon ng mga antibodies sa treponemes sa serum ay tinutukoy ng glow ng treponemes kapag sinusuri sa mikroskopyo ng fluorescence. Ang pagsubok ay isinasagawa sa mga bersyon ng husay at semi-quantitative.

4. Accounting para sa mga resulta

Ang visualization ng mga resulta ng RIF ay isinasagawa gamit ang isang fluorescence microscope. Ang mga resulta ay tinasa ayon sa antas ng luminescence ng treponema sa paghahanda. Sa pagkakaroon ng mga antibodies, ang glow ng treponemes ay makikita, ngunit kung walang anti-treponema antibodies sa serum, kung gayon ang mga treponemes ay hindi makikita. Ang antas ng luminescence ng pinatuyong maputlang treponema na naayos sa salamin ay ipinahiwatig sa "mga plus" (mula sa "-" hanggang "++++"). Negatibong resulta - walang glow o background level - 1+.

5. Sa anong mga panahon ng karamdaman ito ay mas mahusay na gamitin

Ang immunofluorescence reaction (RIF) ay medyo sensitibo sa lahat ng yugto ng impeksyon, mula sa katapusan ng incubation period hanggang sa late syphilis. Ang pangunahing panahon ng syphilis sa klasikal na kurso ay nagsisimula 3-4 na linggo pagkatapos ng impeksiyon. Nagiging positibo ang RIF sa mga unang araw ng primary period o kahit sa pagtatapos ng incubation period, mula sa ika-3 linggo pagkatapos ng impeksyon. Ang mga resulta ng RIF ay nananatiling positibo sa lahat ng mga panahon, kabilang ang sa mga huling anyo.

Ang RIF ay nagiging positibo nang bahagya kaysa sa RV. Ayon sa ilang data, ang positibong RIF ay nangyayari sa 80% ng mga pasyente na may pangunahing seronegative syphilis. Sa pangalawang panahon, ang RIF ay positibo sa halos 100% ng mga kaso. Ito ay palaging positibo sa latent syphilis at nagbibigay ng 95 - 100% positibong resulta sa mga huling anyo ng sakit at congenital syphilis.

6. Sensitivity at specificity

Ang immunofluorescence reaction (RIF) ay isang pangkat ng mga pamamaraan na may mataas na sensitivity at specificity. Ang RIF ay sensitibo sa lahat ng mga yugto ng impeksyon, mula sa panahon ng pagpapapisa ng itlog hanggang sa huli na syphilis. Ayon sa WHO, ang sensitivity ng RIF para sa pangunahing syphilis ay 70-100%, para sa pangalawang at late syphilis - 96-100%, pagtitiyak - 94-100%. Ayon sa TsNIKVI, ang sensitivity ng RIF para sa lahat ng anyo ng syphilis ay 99.1%.

Ang pagiging tiyak ng RIF ay maaaring tumaas sa pamamagitan ng pre-treatment ng test serum na may sorbent - ultrasonicated treponemal antigen na nagbubuklod sa group antibodies (RIF-abs).

7. Saklaw ng aplikasyon ng pamamaraan

Inilapat ang RIF:

• bilang isang confirmatory reaction sa maagang, latent syphilis
• kapag nagtatatag ng retrospective diagnosis
• upang pag-iba-ibahin ang mga nakatagong anyo ng syphilis at mga resulta ng pagsubok na false-positive para sa syphilis.
• bilang isang confirmatory test para sa neurosyphilis.

Ang RIF ay malawakang ginagamit bilang confirmatory test, ngunit hindi ito inilaan para sa regular na paggamit o screening dahil mahirap itong gawin. Upang maisagawa ang RIF, kinakailangan na magkaroon ng vivarium o kumuha ng suspensyon ng pathogenic Treponema pallidum, na naglilimita sa mga posibilidad ng reaksyon. Gayunpaman, sa mga nakaraang taon, ang mga sistema ng pagsubok ay nagsimulang lumitaw sa domestic market na nagpapahintulot sa reaksyon na maisagawa sa kawalan ng isang vivarium at sarili nitong laboratoryo strain ng pathogenic Treponema pallidum.

8. Mga pinagmulan at sanhi ng mga error sa panahon ng produksyon, false positive at false negatibong resulta

Ang mga LPR ay bihira kapag ang RIF ay nasuri (sa collagenosis, borreliosis).

Ang RIF ay itinuturing pa rin na isa sa mga pinakamahusay na pagsusuri para sa syphilis, ang "gold standard" ng serodiagnosis. Ang RIF ay mas madaling i-set up kaysa sa RIBT,

Sa kabila ng mataas na halaga ng diagnostic nito, ang malawakang pagpapakilala ng RIF sa pang-araw-araw na kasanayan ay nahahadlangan ng pangangailangang gumamit ng live na T. pallidum, ang mataas na gastos at tagal ng pag-aaral. Ang pag-set up ng isang reaksyon ay labor-intensive. Bilang karagdagan, ang pagtatasa ng mga resulta ng RIF ay subjective.

Mga kalamangan ng RIF at ang RIBT ay:

1) Mataas na sensitivity (lalo na para sa RIF);

2) Mataas na pagtitiyak (lalo na para sa RIBT).

Mga disadvantages ng RIF at RIBT:

1) Teknikal na kumplikado, mataas na halaga ng mga pamamaraan.

2) Subjectivity ng pagsusuri ng mga resulta, kakulangan ng automation;

3) Ang RIF at RIBT sa mga pasyenteng may syphilis ay maaaring manatiling positibo sa loob ng maraming taon (at maging habang buhay), sa kabila ng pagtanggap ng ganap na paggamot. Samakatuwid, ang mga reaksyong ito ay hindi maaaring gamitin upang subaybayan ang lunas.

10. Mga pagbabago sa pamamaraan

Sa pagsasagawa, ang ilang mga pagbabago ng immunofluorescence reaksyon ay at ginamit para sa serodiagnosis ng syphilis:

• RIF-abs- ang pinaka-sensitibong paraan ng serodiagnosis ng syphilis, nagiging positibo ito nang mas maaga kaysa sa iba pang mga reaksyon (mula sa ika-3 linggo mula sa impeksyon);
• RIF-200(Ang suwero ng pasyente ay natunaw ng 200 beses sa pagsusuri) - isang lubos na tiyak na paraan para sa serodiagnosis ng syphilis.
• RIF-10(10-fold dilution ng test serum) ay isang mas sensitibong paraan kaysa RIF-200.
• RIF-ts isinasagawa gamit ang alak.
• RIF-abs-IgM- pagtuklas ng maagang antitreponemal antibodies ng klase ng IgM.

1. Ang pinakalaganap na pagbabago ay RIF-abs- immunofluorescence reaksyon na may pagsipsip. Bago isagawa ang reaksyon, ang serum ng pasyente ay nauubos na may pinaghalong non-pathogenic treponemes upang maalis ang mga cross-reaksyon. Ang mga antibodies ng grupo ay tinanggal mula sa serum ng pagsubok gamit ang mga kultural na treponema na nawasak ng ultrasound, na makabuluhang pinatataas ang pagtitiyak ng reaksyon. Dahil ang test serum ay ginagamit sa isang 1:5 dilution, RIF-abs ay lubhang sensitibo.

Ang mga pangunahing indikasyon para sa paggamit ng RIF-abs ay: klinikal na kasanayan ay:

• diagnosis ng latent at late forms ng syphilis,
• pagkilala sa mga maling positibong resulta ng CSR at kanser sa pantog, lalo na sa mga buntis na kababaihan at mga pasyenteng somatic na may pinaghihinalaang syphilis,
• upang magtatag ng isang retrospective diagnosis ng sakit.

Ang RIF-abs ay hindi masyadong nagbibigay-kaalaman kapag tinatasa ang mga resulta ng paggamot: sa 85% ng mga pasyente na nakatanggap ng sapat na antisyphilitic therapy, ang mga positibong resulta ng RIF ay nananatili sa loob ng maraming taon.

Ang reaksyong ito ay tinatawag na "gold standard" para sa serodiagnosis ng syphilis. Ito ay ginagamit para sa mga kaso ng arbitrasyon, ngunit para sa isang maaasahang resulta, isang sariwang puro suspensyon ng T. pallidum strain Nichols mula sa pitong araw na orchitis sa isang kuneho ay kinakailangan, na hindi maaaring frozen.

2. Sa USSR ito ay na-install sa dalawang pagbabago - RIF-10 At RIF-200, i.e. na may pagbabanto ng test serum ng 10 at 200 beses. RIF-200 - ang test serum ay natunaw ng 200 beses upang mabawasan ang bilang ng mga maling positibong resulta. Nagbibigay ito ng mataas na pagtitiyak ng reaksyon, ngunit medyo bumababa ang sensitivity nito. Ang RIF-10 ay mas sensitibo, ngunit mas madalas na nagbibigay ng hindi tiyak na mga positibong resulta kaysa sa RIF-200, na lubos na partikular. Ang RIF-10 ay mas sensitibo, ang RIF-200 at RIF-abs ay mas tiyak.

Ang sensitivity ng RIF-200 at RIF-abs ay tinatantya na 84-99%, at ang pagtitiyak ay 97-99%.

3. RIF-ts isinasagawa gamit ang alak. Ang reaksyon ay ginagawa gamit ang buong cerebrospinal fluid upang matukoy ang mga partikular na sugat ng central nervous system.

4. Reaksyon RIF-abs-IgM iminungkahi para sa pagtuklas ng maagang anti-treponemal antibodies ng klase ng IgM. Maaaring gamitin ang reaksyong ito upang masuri ang congenital syphilis, maagang anyo ng syphilis at differential diagnosis mga kaso ng reinfection at serorelapse.

Mayroong 2 kilalang pagbabago ng reaksyong ito:

– FTA-ABS-IgM, batay sa paggamit sa ikalawang yugto ng reaksyon ng isang anti-IgM conjugate (mga antibodies na may label na fluorescein sa IgM ng tao) sa halip na anti-human fluorescent globulin;

– Ruso na bersyon ng RIF-abs-IgM, na nailalarawan sa na isang sorbent ay idinagdag sa serum ng dugo na sinusuri na nag-aalis ng IgG antibodies, at ang RIF-abs ay pinangangasiwaan kasama ang natitirang IgM antibodies.

Pangunahing indikasyon para sa pagsusuri ng RIF-abs-IgM ay:

– serodiagnosis ng congenital syphilis sa kawalan ng mga pagpapakita ng congenital syphilis sa balat at mauhog na lamad sa bata;

– differential diagnosis ng reinfection at clinical-serological o serological relapse ng syphilis, kung saan ang RIF-abs-IgM ay magiging negatibo, at ang RIF-abs ay magiging positibo;

– pagtatasa ng pagiging epektibo ng therapy para sa maagang nakuha o congenital syphilis: pagkatapos ng sapat na paggamot, ang RIF-abs-IgM ay nagiging negatibo sa susunod na 3-6 na buwan.

Ang reaksyong ito ay maaaring gamitin upang makita ang congenital syphilis. Alam na ang malalaking molekula ng IgM ay hindi makakadaan sa isang malusog na inunan. Dahil dito, ang mga antibodies ng class M laban sa Treponema pallidum ay maaaring lumitaw sa katawan ng bata o bilang resulta ng isang karamdaman. pag-andar ng hadlang inunan o ang mga ito ay ginawa ng katawan ng isang batang may syphilis. Ang mga antibodies ng klase ng IgM ay lumilitaw sa dugo ng isang pasyente na may syphilis na nasa mga unang linggo ng sakit, at ang mga antibodies ng klase ng IgG ay lilitaw sa ibang pagkakataon. Ang hiwalay na pagpapasiya ng mga antibodies ng parehong mga klase ay lumalabas na lubhang kapaki-pakinabang sa pag-diagnose ng congenital syphilis sa mga bata, dahil ang pagkakaroon ng IgM class antibodies sa isang bata sa unang buwan ng buhay ay magpahiwatig na sila ay nabuo ng katawan ng isang bata na may syphilis , habang ang pagtuklas ng mga antibodies ng IgG lamang ay magsasaad ng maternal na pinagmulan ng huli.

Pag-set up ng isang reaksyon 19S(IgM)-RIF-abs nagsasangkot ng paunang paghihiwalay gamit ang gel filtration ng mas malalaking 19S IgM molecule mula sa

mga fraction ng mas maliliit na 7S IgG molecule. Karagdagang pag-aaral sa RIF-abs reaction ng blood serum na naglalaman lamang ng 19S IgM fraction,

inaalis ang lahat ng posibleng pinagmumulan ng mga pagkakamali. Ngunit ang pamamaraan para sa pagtatanghal ng reaksyong ito ay kumplikado at masinsinang paggawa, na nangangailangan ng espesyal na kagamitan at pagsasanay sa espesyalista.

Reaksyon ng immune adhesion (RIP, TPIA - Treponema pallida immunoadherence).

Ang reaksyong ito ay batay sa paggamit ng isang phenomenon na inilarawan ni Rieckenberg noong 1912. Ang RIP ay batay sa katotohanan na ang virulent tissue treponema, sensitized ng serum ng isang pasyente na may syphilis, sa pagkakaroon ng complement at erythrocytes, ay sumusunod sa ibabaw ng mga erythrocytes at, sa panahon ng centrifugation, ay dinadala sa kanila sa sediment, nawawala. mula sa supernatant.

Upang i-set up ang reaksyon, ginagamit ang mga sumusunod na sangkap: test serum, antigen, complement, donor red blood cell, isotonic sodium chloride solution. Ang isang suspensyon ng maputlang treponema strain Nichols ay ginagamit bilang isang antigen.

Ang pagsusulit na ito ay pinakamalawak na pinag-aralan kaugnay ng serodiagnosis ng syphilis ng mga domestic at dayuhang may-akda noong 50-60s. Ang ebidensiya tungkol sa halaga ng RIP bilang diagnostic test ay hindi naaayon. Ang reaksyon ay nangangailangan ng pinakamataas na katumpakan, dahil ang hindi tumpak na pagbibigay ng mga sangkap o labis o kakulangan ng materyal sa pagsubok sa paghahanda ay nagresulta sa hindi maaasahang mga resulta.

Sa Russia, ang malawak na pananaliksik ay isinagawa ni L.V. Sazonov, na nakakuha ng katulad na mga resulta sa RIP at RIT gamit ang isang sariwang inihanda na suspensyon ng pathogenic pallidum treponema strain Nichols. Gayunpaman, ang paggamit ng heated o phenol-preserved antigen ay matalas na nasira ang mga resulta ng reaksyon at ginawang hindi matatag ang antigen. Irekomenda ang pagsubok na ito upang palitan ang RIT L.V. Itinuring ito ni Sazonova na imposible.

G.P. Si Avdeeva, na gumamit ng iba pang mga temperatura at rehimen ng oras sa paggawa ng antigen, ay nakakuha ng iba't ibang mga resulta kapag nag-aaral ng RIP. Ayon sa kanyang data, ang sensitivity ng reaksyong ito ay mas mataas kaysa sa sensitivity ng KCP at RIT, ngunit medyo mas mababa sa RIF, at malapit na ang specificity ng RIP, RIT at RIF.

Gayunpaman, ang kakulangan ng pang-industriya na produksyon ng antigen para sa RIP ay hindi pinahintulutan ang pagsubok na ito na mas malawak na pinag-aralan at ipinakilala sa pagsasanay.

RPHA passive hemagglutination reaksyon

Passive hemagglutination reaction (RPHA) ay isang pangkaraniwang serological test na matatag na itinatag sa pagsasanay sa laboratoryo. ay may medyo mataas na antas ng kahusayan sa pananaliksik.

1. Kasaysayan ng paraan ng RPGA

Sa unang pagkakataon, ang paggamit ng RPHA para sa pagsusuri ng syphilis ay iniulat ni G. Blumental at W. Bachman (1932). Noong 1965, iminungkahi ang isang indirect o passive hemagglutination test upang masuri ang syphilis. Ang pagbabago ng reaksyon gamit ang iba't ibang antigens ay iniulat ni Ratlev T. noong 1965 - 1967. Ang micromodification ng RPGA ay iminungkahi ni Sokh R.M. at mga kapwa may-akda noong 1969. Ang unang commercial test system ay binuo ng mga Japanese scientist na si Tomisava et. al. noong 1969

2. Ang prinsipyo ng pamamaraang RPGA

Mula sa isang handa na homogenous na suspensyon ng mga erythrocytes na "na-load" ng mga antigen, sa pagdaragdag ng test serum na naglalaman ng mga antibodies, isang namuo sa anyo ng mga natuklap na namuo. Ang resultang precipitate ay binubuo ng mga pulang selula ng dugo na "nakadikit" na may mga antibodies, at tinatawag "hemagglutinate". Ang pagsususpinde ng mga pulang selula ng dugo ay inihanda nang maaga at ibinibigay bilang bahagi ng mga diagnostic test system.

Ang proseso ng pagdikit-dikit ng mga pulang selula ng dugo na may mga antigen sa ibabaw nito ay tinatawag na "hemagglutination." Ang pagbubuklod ay nangyayari sa ilalim ng pagkilos ng mga tiyak na antibodies (agglutinins). Ang reaksyon ay tinatawag "passive", dahil ang sariling mga antigen ng erythrocytes ay hindi tumutugon, at ang mga erythrocyte mismo ay gumaganap ng eksklusibo ng isang pantulong na function na tagapagpahiwatig.

Ang passive (indirect) hemagglutination reaction ay isang uri ng agglutination reaction kung saan ang mga erythrocytes (mula sa Griyegong háima - dugo), at hindi iba pang mga particle, ang ginagamit bilang antigen carriers. Sa pangkalahatan, sa agglutination reaksyon, sa ilalim ng impluwensya ng mga antibodies, microbes o iba pang mga cell dumikit at namuo - hindi kinakailangang pulang selula ng dugo, ngunit, halimbawa, latex particle, bakterya o iba pang antigen-tindig corpuscular particle.

Sa passive hemagglutination reaction para sa pag-diagnose ng syphilis, ang mga erythrocyte ng tupa o ibon na pinahiran ng Treponema pallidum antigens ay ginagamit bilang isang antigen. Kapag ang serum na naglalaman ng mga tiyak na antibodies ay idinagdag, ang mga pulang selula ng dugo ay magkakadikit (agglutination).

Ang reaksyon ng RPGA ay inuri bilang isang immunological na paraan, dahil ito ay batay sa tiyak na pakikipag-ugnayan ng pathogenic Treponema pallidum antigen na may isang antibody. Ayon sa "teorya ng sala-sala," ang agglutination ay resulta ng "cross-linking" ng mga molekula ng antigen sa ibabaw na may mga molekula ng antibody (immunoglobulins).

3. Pagse-set up ng passive hemagglutination reaction

Ang RPGA ay inilalagay sa mga plastic na tablet o sa mga test tube na may mga dilution ng serum ng dugo ng pasyente, kung saan idinagdag ang isang erythrocyte diagnosticum.

Ang proseso ng pagsasama ng isang antigen sa mga erythrocytes ay tinatawag na sensitization, at ang artipisyal na corpuscular antigen na nakuha ay tinatawag na sensitized erythrocytes. Erythrocyte diagnosticum tinatawag na erythrocytes na sensitized ng isang antigen.

Upang ihanda ang diagnosticum, ang mga erythrocytes mula sa mga tupa o ibon (karaniwang manok), unang ginagamot sa formaldehyde at pagkatapos ay tannin, ay ginagamit, na kung saan ay sensitized na may ultra-sound antigen ng pathogenic treponema pallidum (Nichols strain) o recombinant treponema pallidum proteins (TpN15, TpN17, TpN47). Ang mga erythrocyte ng tupa na na-sensitize sa ultrasonic antigen ng kulturang Treponema pallidum ay maaari ding gamitin.

Serum lamang ang sinusuri (huwag gumamit ng plasma ng dugo). Ang mga hemolyzed at turbid na sample ay hindi angkop. Ang mga di-sensitized na erythrocyte ay nagsisilbing negatibong kontrol (upang ibukod ang pagkakaroon ng mga anti-erythrocyte antibodies). Sa bawat serye ng mga produksyon, positibo at negatibong kontrol ang ginagamit.

Ang mga sample ng test blood serum at test red blood cells ay idinaragdag sa mga balon (wells) ng immunological tablet. Kung ang serum ng dugo ng pasyente ay naglalaman ng mga tiyak na anti-treponemal antibodies, pagkatapos kapag ang test serum ay idinagdag sa balon na may antigen, ang pagbuo ng mga antigen-antibody complex na nauugnay sa ibabaw ng mga carrier (erythrocytes) ay nangyayari. Biswal, ito ay ipinahayag sa pamamagitan ng gluing ng mga pulang selula ng dugo, i.e. hemagglutination, na nakikita ng mata. Ang mga immune complex na "antibody-antigen-erythrocyte", na unti-unting nahuhulog sa ilalim ng impluwensya ng grabidad, ay ipinamamahagi sa buong ibabaw ng ilalim ng butas at bumubuo ng isang katangian na larawan ng isang "baligtad na payong".

Depende sa dami ng mga antibodies na nilalaman sa sample ng pagsubok, ang imahe ng "baligtad na payong" ay nag-iiba mula sa maximum, na sumasakop sa buong ibabaw ng ilalim ng balon, hanggang sa isang maliit na lugar sa gitna, pinakamababang bahagi (na may clearing sa ang gitna at ang pagbuo ng isang mas matinding singsing ng mga naayos na pulang selula ng dugo sa paligid).

Ang mga immune complex ay hindi nabubuo kung walang mga partikular na antibodies sa sample o kapag ang kontrol (buo) na mga pulang selula ng dugo ay idinagdag sa reaksyon. Kasabay nito, ang mga pulang selula ng dugo ay unti-unting nakolekta sa pinakamababang punto ng ilalim ng butas, na bumubuo ng isang pigura sa anyo ng isang compact spot o "button", kung minsan ay may bahagyang pag-clear sa gitna.

Kung ang serum ng dugo ng isang tao ay naglalaman ng mga anti-erythrocyte antibodies, kung gayon ang isang "payong" ay bubuo sa anumang kaso - kapwa sa reaksyon sa mga pagsubok na erythrocytes at may kontrol na mga erythrocytes. Sa kasong ito, inirerekumenda na gumamit ng iba pang mga medikal na teknolohiya upang makilala ang mga tiyak na antitreponemal antibodies.

Ang kababalaghan ng prozone (imposibilidad ng reaksyon dahil sa labis na antibodies) ay posible, na maaaring alisin sa pamamagitan ng pagtunaw ng suwero.

4. Accounting para sa mga resulta ng passive hemagglutination reaksyon

Ang mga resulta ng RPGA ay isinasaalang-alang nang biswal pagkatapos ng 60-120 minuto kapag nagse-set up ng micro-method at pagkatapos ng 2-4 na oras o sa susunod na araw kapag nagse-set up ng macro-method. Kapag gumagamit ng mas malalaking (nucleated) avian erythrocytes, isang mas malinaw na larawan ang nakuha, at ang mga resulta ay naitala sa mas maagang oras.

Posibleng matukoy ang titer (high titer RPHA ≥ 1:2 560).

Ang mga resulta ng pag-aaral ay tinasa gamit ang 4+ system (mula sa “–” hanggang “++++”) batay sa laki ng nabuong pelikula. Kapag nangyari ang aglutinasyon, ang mga pulang selula ng dugo ay matatagpuan sa ibabaw ng butas sa anyo ng isang "payong", at kung ang resulta ay negatibo, ang mga pulang selula ng dugo ay malayang dumudulas at maipon sa ilalim sa gitna ng butas sa ang anyo ng isang "button".

Pangkalahatang tinatanggap na pagtatasa ng mga resulta ng RPGA:

4+ - positibong RPGA. Ang pinagsama-samang mga pulang selula ng dugo sa anyo ng isang "payong" ay pantay na nakahanay sa buong ibabaw ng butas;

3+ - positibong RPGA. Ang mga pulang selula ng dugo ay nakahanay sa buong ibabaw ng butas, ngunit ang ilan sa mga ito ay "slide" sa gitna. Sa kasong ito, ang isang kapansin-pansing singsing ay nabuo sa kahabaan ng periphery ng sediment;

2+ - mahinang positibong RPHA. Ang mga pulang selula ng dugo ay bumubuo ng isang pelikula sa isang maliit na lugar ng ibabang bahagi ng butas, na bumubuo ng isang siksik na singsing ng pulang selula ng dugo na sediment na may kapansin-pansing pag-clear sa gitna;

1+ - hindi tiyak na RPHA, ang mga pulang selula ng dugo ay bumubuo ng isang maluwag na sediment sa ilalim ng balon na may hindi malinaw na mga gilid at isang bahagyang lumen sa gitna;

(–) - negatibong RPGA, lahat ng pulang selula ng dugo ay nakahiga sa ilalim ng balon sa anyo ng isang compact na sediment ("mga buton" o mga singsing) laban sa isang malinis na background sa paligid (nang walang nakapaligid na butil na sediment).

Sa dayuhang pagsasanay, ang mga resulta ng RPGA ay tinasa din bilang reaktibo (sa kaso ng pagbuo ng agglutinate), mahinang reaktibo (kung ang mga pormasyon ay hindi gaanong mahalaga) at hindi reaktibo (kung hindi sinusunod ang aglutinasyon).

Ang mga resulta ng reaksyon ay maaaring awtomatikong maitala gamit ang mga espesyal na analyzer. Bilang karagdagan sa qualitative research, lahat ng test system ay nagbibigay ng quantitative analysis na may titer determination.

5. Sa anong mga panahon ng sakit mas mainam na gumamit ng RPHA?

Nagiging positibo ang RPHA sa gitna ng pangunahing panahon (7-8 linggo mula sa sandali ng impeksyon, 3-4 na linggo pagkatapos ng paglitaw ng chancre) at nananatiling positibo sa loob ng maraming taon pagkatapos ng paggamot.

Sa napakataas na antas ng antibodies sa treponema sa test serum (na pinaka-karaniwan para sa pangalawang syphilis), posible ang isang maling negatibong resulta ng RPGA (ang tinatawag na "prozone" phenomenon).

Ang mga partikular na agglutinin antibodies ay nakita sa dugo ng mga taong may syphilis sa loob ng mahabang panahon, kaya hindi mairerekomenda ang RPGA para sa differential diagnosis ng reinfection o pagtukoy sa kalubhaan ng nakakahawang proseso.

Ang RPGA ay hindi ginagamit upang kontrolin ang lunas, dahil maaaring manatiling positibo maraming taon pagkatapos ng paggaling. Kasabay nito, maaari itong magamit bilang isang karagdagang (sa kanser sa pantog o sa RPR) na pamamaraan sa pagsubaybay sa pagiging epektibo ng paggamot sa pamamagitan ng pag-aaral sa dinamika ng pagbaba ng mga titer ng antibody. Ang isang kinakailangan para dito ay ang paggamit ng parehong sistema ng pagsubok ng RPGA tulad ng sa unang (bago ang paggamot) na pagsusuri ng pasyente, pati na rin ang pagsusuri sa parehong laboratoryo.

6. Sensitivity at specificity ng RPGA

Ang RPGA ay itinuturing na isang napaka-sensitibo at partikular na pagsubok. Ang reaksyong ito ay isang mahalagang diagnostic test para sa lahat ng anyo ng syphilis, ngunit ito ay lalong sensitibo sa mga huling anyo ng sakit. Depende sa yugto ng sakit, ang sensitivity ng RPGA ay nag-iiba. Sa pangunahing syphilis, ang sensitivity ng RPGA ay 76% (at mas mataas), na may pangalawang syphilis - hanggang sa 100%. Para sa latent early syphilis - 97%, para sa late syphilis - 94%, na may specificity na 98-100%. Ang mas mababang sensitivity sa mga sariwang anyo ng sakit ay ipinaliwanag sa pamamagitan ng mamaya na pagbuo ng mga agglutinin.

Ayon sa Institusyon ng Estado "TsNIKVI Roszdrav", ang sensitivity ng RPGA sa pag-diagnose ng iba't ibang anyo ng syphilis ay 99.4%. Karamihan sa mga mananaliksik ay nagpapansin ng 98-99% na pagtitiyak para sa RPHA.

Sa mga tuntunin ng pagiging sensitibo at pagtitiyak, ang RPGA ay hindi mababa, at sa mga huling anyo at congenital syphilis ay mas mataas pa ito sa RIF at RIBT.

7. Saklaw ng aplikasyon ng pamamaraang RPGA

Maaaring gamitin ang RPGA bilang isang screening at confirmatory test; ay maaaring gamitin sa isang semi-quantitative na bersyon na may pagkalkula ng antibody titer. Ang isang quantitative na paraan para sa pagtatanghal ng RPHA, isang micromethod, pati na rin ang isang automated na reaksyon ng microhemagglutination ay binuo.

8. Mga tampok, pakinabang at disadvantages ng RPGA

Ayon sa panitikan, ang RPGA ay patuloy na nangunguna sa klinikal na kasanayan sa karamihan ng mga bansa sa mundo. Ang RPGA ay ang pinakamalawak na ginagamit na pagsubok sa mga klinika ng STI sa ibang bansa.

Ang diskarteng RPGA ay madaling gawin at hindi nangangailangan ng espesyal na kagamitan: ang kailangan mo lang ay isang hemagglutination plate. Ang pananaliksik ay hindi tumatagal ng mahabang panahon; ang reaksyon ay lubhang sensitibo at tiyak. Ang pagsubok sa pamamaraan sa klinikal na kasanayan ay nagpakita na ito ay napakasimple, mura at sensitibo. Tulad ng ELISA, ang RPGA ay simpleng gawin, hindi nangangailangan ng mataas na kwalipikadong tauhan at espesyal na kagamitan, at posible ang automation nito.

Mga kalamangan ng pagsubok ng RPGA:

• madaling i-set up at bigyang-kahulugan,
• hindi nangangailangan ng espesyal na kagamitan,
• oras upang makakuha ng mga resulta - 45 minuto,
• angkop para sa mass screening (25 µl lamang ng serum na diluted 1:20 ang kailangan),
• mataas na antas ng standardisasyon,
• pagkakaroon ng mga panloob na kontrol,
• mahabang buhay sa istante,
• katanggap-tanggap na presyo
• posibilidad ng accounting automation.

Ang mga disadvantages ng RPGA ay dapat ding tandaan:

• ang posibilidad ng mga nonspecific na reaksyon sa pagkakaroon ng mga anti-erythrocyte antibodies,
• kakulangan ng ugnayan sa pagitan ng titer at yugto ng syphilis,
• mamaya positibong reaksyon sa mga maaga mga yugto ng syphilis,
• ang posibilidad ng maling positibong reaksyon sa mga taong umiinom ng alak, mga adik sa droga,
• sensitivity sa vibration at temperatura sa laboratoryo.

Ang mga pakinabang ng RPGA kumpara sa RIBT at RIF ay:

• paggamit ng mga sistema ng pagsubok sa industriya,
• posibilidad ng pag-automate ng reaksyon,
• hindi na kailangang magtrabaho kasama ang live na Treponema pallidum,
• hindi na kailangan ng vivarium.

9. Mga pinagmulan at sanhi ng mga error kapag nagsasagawa ng RPGA, false positive at false negative na resulta

Ang passive hemagglutination test ay medyo simpleng pagsubok; kapag isinasagawa ito, kinakailangang sundin ang lahat ng mga rekomendasyon ng mga tagagawa ng diagnosticum at ang mga patakaran ng trabaho sa clinical diagnostic laboratory. Ang mga pagkakamaling nagawa ay maaaring humantong sa paglitaw at pagpaparehistro ng parehong maling negatibo at maling positibong resulta ng reaksyon. Ang mga maling positibong resulta ng RPGA ay maaaring dahil sa impluwensya ng tao at biological na mga kadahilanan.

Maaaring makuha ang mga maling positibong resulta

• kapag nag-aaral ng blood sera ng mga pasyente na may non-venereal treponematoses,
• dahil sa rheumatoid factor
• dahil sa mga antibodies na cross-reacting sa treponemal antigen, na nabuo sa panahon ng iba't ibang systemic o dulot ng droga na metabolic disorder,
• dahil sa abnormal na antas ng immunoglobulins;
• sa mga bagong silang - dahil sa pagbuo sa katawan ng fetus o bata ng IgM antibodies sa IgG ng ina, na nagpapalubha sa interpretasyon ng mga resulta at ang diagnosis ng congenital syphilis.

Mga error na dulot ng impluwensya ng partisipasyon ng tao sa pag-aaral:

• kontaminadong microplate
• maling pipetting
• pagkakaroon ng vibration sa laboratoryo
• Ang temperatura ng hangin sa laboratoryo ay nasa labas ng hanay ng temperatura: 18–25 degrees

Ang pinakakaraniwang mga teknikal na error kapag nagsasagawa ng RPGA, na humahantong sa hindi mapagkakatiwalaang mga resulta, ay kinabibilangan ng:

• hindi tumpak na pagbabanto ng mga sangkap,
• paglabag sa temperatura,
• paglabag sa oras ng pagpapapisa ng itlog ng mga reagents,
• paglabag sa mga deadline para sa paglalapat ng mga reagents sa tablet,
• pagkakaiba sa pagitan ng pH ng mga solusyon at ang mga kinakailangan,
• kontaminasyon ng mga babasagin sa laboratoryo.

Ang mga sumusunod na teknikal na isyu ay maaari ding pinagmulan ng mga error kapag nagse-set up ng RPGA:

• pagbubukod ng control blood sera mula sa reaksyon;
• hindi pantay na konsentrasyon ng mga pulang selula ng dugo sa diagnosticum dahil sa hindi sapat na paghahalo bago gamitin;
• paglabag sa mga tuntunin at kundisyon ng imbakan ng diagnosticum at kontrolin ang mga pulang selula ng dugo; gamit ang mga kit na may nag-expire na kaangkupan;
• paggamit ng mga kontaminadong test tubes, pipette tip, pipettes, immunological plates, solusyon kapag nagsasagawa ng mga reaksyon;
• mga kamalian sa paunang pagbabanto ng sample ng suwero;
• hindi sapat na pangangalaga sa pagsasagawa ng mga serial double dilution;
• hindi pagsunod sa mga kondisyon ng temperatura at oras ng pagpapapisa ng itlog;
• ang pagkakaroon ng mga extraneous vibrations at pag-alog ng immunological tablet sa panahon ng pagpapapisa ng itlog;
• paglabag sa pamamaraan para sa pagtatanghal ng RPGA, na ipinahayag sa pagtanggi na isagawa ang pag-aaral na may control erythrocytes.

Ang paggamit ng plasma ng dugo na naglalaman ng mga anticoagulants na maaaring magdulot ng nonspecific erythrocyte agglutination (RPGA) ay maaaring humantong sa mga resulta na hindi mabibigyang-kahulugan.

Bilang ng mga maling positibo at mali negatibong resulta mas mababa kaysa sa iba pang mga serological test. Ang mga LPR kapag ang pagtatanghal ng RPHA ay bihira at posible sa mga treponematoses (yaws, bejel, pinta). Gayundin, ang mga maling-positibong resulta ay naitala (mas mababa sa 1% sa kabuuan) sa mga adik sa droga, sa mga pasyenteng may nakakahawang mononucleosis, borreliosis, ketong, collagenosis, cirrhosis sa atay, lymphosarcoma, gayundin sa mga buntis na kababaihan.

Ang mga maling-negatibong resulta ng pagsubok ay maaaring dahil sa kumpetisyon sa pagitan ng IgM at IgG antibodies. Posible rin ang mga maling negatibong resulta sa mga pasyenteng nahawaan ng HIV.

10. Mga pagbabago sa paraan ng RPGA

Mayroong micro- at macro-modifications ng RPHA setup; ang una ay mas madalas na ginagamit dahil sa kahusayan nito, bilis ng pag-setup at pagtatala ng mga resulta.

Bilang karagdagan, ang isang awtomatikong diagnostic complex para sa pagsusuri ng imahe ay binuo, na naging posible upang magsagawa ng isang dami ng awtomatikong pagtatasa ng mga resulta at alisin ang pagiging subject sa interpretasyon ng data na nakuha. Kinikilala ng hardware at software complex ang imahe, pinoproseso ang data at nagbibigay ng sagot sa mga relatibong unit.

Upang i-automate ang pagtatala ng mga resulta ng RPGA, ginagamit din ang mga mambabasa at awtomatikong analyzer.

TPPA (Treponema pallidum particle agglutination) - agglutination reaksyon ng mga artipisyal na particle upang makita ang mga antibodies sa Treponema pallidum

Maikling Paglalarawan ng TPPA Test

Sa kasalukuyan, ang isang pagbabago ng paraan ng passive hemagglutination - TPPA (Treponema pallidum particle agglutination), kung saan ang Treponema pallidum antigen ay naayos sa mga particle ng gelatin, ay ginagamit din upang masuri ang syphilis. Dahil ang mga artificial polymer particle ay walang sariling antigens na tumutukoy sa biological activity, ang mga kit para sa syphilis serodiagnosis batay sa mga ito ay may dahilan upang ituring na mas advanced. Ang paggamit ng biologically inert artificial particles ay nagpapaliit ng hindi tiyak na agglutination na karaniwang nakikita sa ibang mga sasakyan.

Ginagamit ang TPPA para sa serological diagnosis ng mga antibodies sa iba't ibang species at subspecies ng pathogenic Treponema. Ang pagsusulit na ito ay maaaring gamitin upang makita ang mga antibodies sa mga pathogens na syphilis, pint, bejel at yaws.

Ang pamamaraan ng pananaliksik ay napaka-simple at hindi nangangailangan ng mga espesyal na kagamitan - ginagamit ang karaniwang "U" na mga microplate. Ang pagsusuri ay batay sa agglutination ng mga particle ng gelatin na na-sensitized sa T. pallidum antigens, mga antibodies na nasa blood serum ng pasyente.

Ang TPPA ay isang confirmatory treponemal test na kapaki-pakinabang para sa parehong maliit na sample testing at mass screening. Ginagamit ang TPPA sa ibang bansa bilang confirmatory test at para palitan ang micro-hemagglutination test na MHA-TP (microhemagglutination assay para sa antibodies sa T. pallidum).

Ang sensitivity ng TPPA test ay nasa pagitan ng 85% at 100%, at ang specificity ay nasa pagitan ng 98% at 100%. Ang sensitivity ng TPPA para sa pangunahing syphilis ay 88%, para sa pangalawang at late latent syphilis 98%-100%.

Kung ang TPPA ay ginagamit upang masuri ang syphilis, ang mga antibodies sa iba pang treponemes (gaya ng T. pallidum endemicum, pertenue, o carateum) ay maaaring magdulot ng mga false-positive na resulta. Mayroong ilang mga paraan na magagamit upang alisin ang mga antibodies na ito mula sa mga sample ng serum bago ang pagsubok.

Prinsipyo ng TPPA test

Ang TPPA ay isang paraan ng passive agglutination ng mga particle ng gelatin sa serum o plasma ng tao. Ang serum na naglalaman ng mga antibodies sa pathogenic treponema ay tumutugon sa mga particle ng gelatin na na-sensitized sa antigen ng maputlang treponema strain Nichols, na sumailalim sa ultrasound. Bilang resulta ng reaksyon, ang isang makinis na pelikula ng agglutinated gelatin particle ay nabuo sa balon ng microtiter plate.

Kung ang mga antibodies ay wala, kung gayon ang mga particle ay tumira sa ilalim ng balon ng plato, na bumubuo ng isang compact na "button" ng mga di-agglutinated na mga particle. Dapat ding ipakita ng mga control well na may non-sensitized gelatin particle ang compact na "button" na ito para sa bawat serum, ibig sabihin, walang agglutination.

Paglalapat ng TPPA test

Ang TRPA ay isang unibersal na layunin na pagsubok na maaaring pantay na matagumpay na magamit sa panahon ng mandatoryong preventive na pagsusuri ng mga pangkat ng populasyon para sa syphilis (screening) at sa mga espesyal na institusyong dermatovenerological. Ang bentahe ng pagsubok sa TPPA ay ang mataas na sensitivity nito, na hindi mababa sa mga klasikal na pagsusulit, na hanggang kamakailan ay ang "pamantayan ng ginto" para sa serodiagnosis ng syphilis. Kasama sa iba pang mga bentahe ng pagsubok ang mataas na reproducibility, pati na rin ang pagiging simple at bilis ng pag-set up ng reaksyon.

Ginagamit ang TPPA test upang kumpirmahin ang mga positibong resulta mula sa mga pagsusuri sa pagsusuri ng nontreponemal syphilis, tulad ng VDRL test, at upang suriin ang mga pasyenteng may negatibong resulta ng pagsusuri na hindi ntreponemal ngunit may mga palatandaan o sintomas na nagpapahiwatig ng late syphilis. Ang paggamit ng TPPA bilang nag-iisang screening test para sa syphilis ay hindi inirerekomenda.

Bilang karagdagan, ang TPPA agglutination test ay maaaring gamitin upang suriin ang mga sample ng cerebrospinal fluid sa diagnosis ng neurosyphilis. Sa kasong ito, tulad ng iba pang mga serological na pagsusuri, ang interpretasyon ng mga resulta ay dapat isagawa sa ipinag-uutos na kumbinasyon sa iba pang mga tagapagpahiwatig at sintomas ng sakit.

Mga resulta ng pagsusulit sa TPPA

Ang resulta ay tinasa ayon sa sistema ng "mga plus" - mula (–) hanggang (2+). Ang mga resulta ng pagsusulit ay nakikita ng mata at binibigyang-kahulugan bilang mga sumusunod:

Degree ng agglutination	Tagapagpahiwatig ng pagsubok	Interpretasyon
Ang mga agglutinated na particle ay pantay na nakahanay sa ilalim ng plato nang maayos	2+	Positibo
Makabuluhang malaking singsing na may hindi pantay na panlabas na mga gilid at peripheral agglutination	1+	Positibo
Ang mga particle ay bumubuo ng isang compact na singsing na may puwang sa gitna at makinis na makinis panlabas na mga hangganan	±	Mahina ang positibo
Ang mga particle ay bumubuo ng isang compact na singsing sa gitna ng butas na may isang bahagyang puwang sa gitna at isang makinis na panlabas na hangganan	–	Negatibo
Ang mga particle ay bumubuo ng isang "button" sa gitna ng butas na may makinis na panlabas na hangganan	–	Negatibo

Isinasaalang-alang ang mga resulta upang matukoy ang pagsunod sa paglalarawan sa itaas. Ang mga sample na nagpapakita ng hindi tiyak na resulta (±) ay dapat muling suriin. Kung ang isang sample ay nagpapakita ng hindi tiyak na resulta sa ilang mga pagsubok sa TPPA, inirerekumenda na subukan ang paggamit ng ibang mga pamamaraan.

Ang mga resulta ng pagsusuri ay hindi dapat tingnan nang hiwalay. Halimbawa, sa maagang yugto impeksyon, ang bilang ng mga antibodies ay masyadong mababa, bilang isang resulta kung saan ang TPPA at maraming iba pang mga pamamaraan ay walang sensitivity. Samakatuwid, kung ang syphilis ay pinaghihinalaang, kahit na ang mga resulta ng pagsusuri ay negatibo, ang mga sample ay dapat masuri muli. Upang makagawa ng diagnosis, kinakailangang isaalang-alang ang mga klinikal na sintomas ng pasyente, klinikal na kasaysayan at iba pang data.

Tulad ng reaksyon ng RPHA, maaaring magpakita ang TPPA ng prozone phenomenon at maling negatibong resulta kung ang sample ng serum ay naglalaman ng masyadong mataas na titer ng antibody.

ELISA - Enzyme immunoassay

Ang Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ay isa sa maraming serological diagnostic na pamamaraan Nakakahawang sakit. Ang enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) sa serodiagnosis ng syphilis ay isang pagsubok para sa mga antibodies ng mga klase M, G at A (IgM, IgG, IgA) laban sa Treponema pallidum antigens. Posibleng magsagawa ng ELISA na may cerebrospinal fluid.

Ang pagpapakilala sa pagsasanay ng enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) sa halip na ang reaksyon ng Wasserman at iba pang mga pagsusuri sa cardiolipin ay makabuluhang nagpabuti sa kalidad ng pagsusuri sa laboratoryo ng syphilis. Ang isang makabuluhang bentahe ng pamamaraang ito ay ang kakayahang i-automate ang proseso ng pananaliksik, na binabawasan ang impluwensya ng kadahilanan ng tao.

1. Kasaysayan ng pamamaraang ELISA

Ang mga pangunahing prinsipyo ng enzyme immunoassay sa ibabaw ng isang solid-phase carrier ay binuo ni E. Engvar at co-author. (1971), B. Van Weeman at A. Schuurs (1971). Ang enzyme immunoassay na kanilang binuo ay unang iminungkahi para sa diagnosis ng syphilis noong 1975 nina J. Veldkamp at A. Visser, na tinasa ang potensyal ng automated na pagsubok na ito. Ang ELISA ay nagsimulang malawakang ginagamit sa pagsusuri ng syphilis noong 1980s, nang ang mga diagnostic test ay binuo at na-certify at ang mga pamamaraan ng pagsubok ay na-standardize. Sa USSR, ang pamamaraan ng ELISA para sa pag-diagnose ng syphilis ay binuo ni V.N. Bednova, A.V. Babiy at A.V. Kotrovsky (1982, 1983).

2. Prinsipyo ng pamamaraang ELISA

Ang enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ay katulad sa mekanismo ng reaksyon sa RIF (ang parehong mga antibodies ay nakita). Ang enzyme immunoassay reaction ay inuri bilang isang immunological reaction batay sa napakaspesipikong interaksyon ng treponema pallidum antigens sa mga antibodies ng isang pasyenteng may syphilis.

Sa syphilidological practice, ang hindi direktang bersyon ng ELISA ay pangunahing ginagamit. Ang prinsipyo ng pinakakaraniwang ginagamit na hindi direktang reaksyon ay ang mga sumusunod. Sa ibabaw ng mga balon ng isang polystyrene tablet, ang mga immune complex ay naayos na nabuo kapag ang mga antibodies ng isang pasyente ng syphilis ay nakikipag-ugnayan sa Treponema pallidum antigens. Pagkatapos nito, sila ay nakita sa isang reaksyon ng kulay gamit ang mga tiyak na conjugates at naaangkop na substrate-chromogenic additives.

Ang pamamaraan para sa pagsasagawa ng pagsubok ay ang mga sumusunod: ang serum ng pasyente ay inilalagay sa isang solid-phase carrier na may isang antigen na nakakabit dito. Kung mayroong mga antibodies dito, ang isang antigen-antibody complex ay nabuo sa ibabaw ng carrier. Upang "ipakita" ang mga resulta ng reaksyon, ginagamit ang mga anti-human Ig antibodies na pinagsama sa mga marker ng enzyme. Sa kaso ng isang positibong reaksyon, ang enzyme na nakakabit sa antigen-antibody complex ay nabubulok ang substrate na idinagdag sa system, na nagreresulta sa pagbuo ng paglamlam ng kulay na may iba't ibang intensity.

Sa reaksyon, ang pagpapasiya ng complex ng AG at AT sorbed sa solid phase ay isinasagawa gamit ang antiglobulin antibodies na may label na enzyme, batay sa reaksyon ng kulay ng enzyme na may substrate.

Sa reaksyon, ang pagpapasiya ng complex ng antigens at antibodies na na-sorbed sa solid phase ay isinasagawa gamit ang antiglobulin antibodies na may label na isang enzyme.

Ang ELISA ay nagbibigay ng kakayahang makakita ng serum Igs ng iba't ibang klase. May mga sistema sa merkado na nagbibigay-daan sa iyong hiwalay na matukoy ang IgM at IgG at kabuuang antibodies.

Ang mga partikular na antigen na ginagamit para sa ELISA ay maaaring magkaroon ng iba't ibang pinagmulan:

ultra-boses- ang mga ito ay nakuha sa pamamagitan ng pagsira sa bacterial cell T. pallidum sa pamamagitan ng ultrasound o ibang paraan;

recombinant- nakuha ang mga ito sa pamamagitan ng mga teknolohiyang genetic engineering sa pamamagitan ng pagpasok sa genome ng isang bacterial cell (halimbawa, coli E.Coli) gene na responsable para sa synthesis ng isang tiyak na T.pallidum antigen, na sinusundan ng pagtaas sa bacterial mass ng gumagawa ng microorganism, pagkasira ng mga cell na ito, paghihiwalay at paglilinis ng antigen;

peptide- nakuha bilang resulta ng sequential chemical synthesis ng antigenic epitopes ng T. pallidum proteins.

Nagagawa ng katawan na bumuo ng mga antibodies sa halos anumang bahagi ng molekula ng antigen. Sa isang normal na tugon ng immune, kadalasang hindi ito nangyayari. Ang isa o higit pang immunogenic peptides na nakahiwalay sa isang antigen ng protina ay may espesyal na antigenicity, at karamihan sa mga antibodies ay partikular na nabuo sa kanila. Ang pinaka matinding immune response ay bubuo sa kanila. Ang pinaka-kaalaman na ELISA ay nagpakita ng mga immunodominant na rehiyon ng mga protina ng Treponema pallidum na may mga molekular na timbang na 15 kDa, 17 kDa at 47 kDa. Ginamit bilang antigen ang isang detergent extract o sonicate ng pathogenic treponemes ng Nichols strain.

3. Paraan ng pagsasagawa ng pananaliksik gamit ang pamamaraan

Ang prinsipyo ng pamamaraan ay upang makita ang isang tiyak na antigen-antibody complex na na-sorbed sa solid phase (sa ibabaw ng mga balon ng isang plastic plate) na may antiglobulin antibodies na may label na isang enzyme (peroxidase) gamit ang isang reaksyon ng kulay sa substrate, kinuha sa account quantitatively spectrophotometrically.

Ang mga antigen na ginagamit upang gawing sensitize ang mga balon ng isang polystyrene plate ay maaaring:

• lysate- nakuha bilang isang resulta ng pagkasira ng Treponema pallidum sa pamamagitan ng ultrasound;
• peptide- nakuha bilang isang resulta ng kemikal na synthesis ng mga fragment ng protina ng Treponema pallidum at pagkakaroon ng antigenic reactivity na katulad ng mga orihinal na protina ng pathogen;
• recombinant- nakuha gamit ang mga pamamaraan genetic engineering, nagdadala ng mga antigenic determinant na kapareho ng Treponema pallidum.

Sa syphilidological practice, karaniwang ginagamit ang hindi direktang bersyon ng ELISA.

4. Accounting para sa mga resulta

Sa ELISA, upang mailarawan ang reaksyon ng antigen-antibody, ang isang enzyme (alkaline phosphatase o horseradish peroxidase) ay tumutugon sa isang substrate, na nagbabago ng kulay. Tinutukoy ng intensity ng kulay ang positivity ng reaksyon (mula sa “–” hanggang “++++”). Ang mga resulta ng ELISA ay maaaring masuri nang biswal gamit ang isang 4-point system o instrumental sa anyo ng mga digital indicator ng optical density na nakuha sa mga espesyal na reader (gaya ng Multiscan) sa wavelength na 492 nm. kasi Ang mga resulta ay tinasa spectrophotometrically, ito ay nag-aalis ng subjective interpretasyon.

5. Sa anong mga panahon ng karamdaman ito ay mas mahusay na gamitin

Ang timing ng ELISA positivity ay mula sa ika-4 na linggo mula sa impeksyon. Ang mga resulta ng ELISA (pati na rin ang RIF) ay nagiging positibo sa mga unang araw ng pangunahing panahon o sa pagtatapos ng pagpapapisa ng itlog at mananatiling positibo sa lahat ng mga panahon. Ang ELISA ay lalong mahalaga sa maagang pagsusuri ng syphilis - ang mga positibong resulta para sa pag-detect ng mga antibodies ay maaaring makuha na sa katapusan ng panahon ng incubation ng sakit (ibig sabihin, 4-6 na linggo pagkatapos ng impeksiyon).

6. Sensitivity at specificity

Ang ELISA ay isang napaka-sensitibo at tiyak na pagsubok, na siyang kalamangan nito. Ang ELISA ay malapit sa RIF sa mga tuntunin ng mekanismo ng reaksyon, sensitivity at pagtitiyak, dahil Ang parehong mga antibodies ay nakikibahagi sa parehong mga reaksyon. Karamihan sa mga mananaliksik ay nagpapansin ng mataas na pagtitiyak at pagiging sensitibo sa lahat ng yugto ng sakit. Ang sensitivity ng iba't ibang mga variant ng ELISA, ayon kay G. A. Dmitriev, ay umabot sa 98-100%, at pagtitiyak - 96-100%. Ayon sa TsNIKVI, ang sensitivity ng ELISA para sa syphilis ay 99.1% (Order No. 87 M3 ng Russian Federation).

Ang opsyon na solid-phase ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) ay isa sa mga pinakasensitibo serological reaksyon, na nagpapahintulot sa pagtuklas ng 0.0005 μg/ml antibodies at 0.000005 μg/ml antigens.

7. Saklaw ng aplikasyon ng pamamaraan

Ang pamamaraan ay inirerekomenda para sa paggamit kapag sinusuri ang mga buntis na kababaihan, mga contact person, mga donor at mga kinatawan ng mga grupo ng panganib. Maaaring gamitin ang ELISA bilang isang screening at confirmatory test. Sa medyo maikling panahon ng kasaysayan nito, ang ELISA ay nagbago mula sa isang indicative na pagsubok tungo sa isang confirmatory. Sa diagnosis ng syphilis, ginagamit din ang pagsusuri bilang confirmatory test para sa mga sample na nagpapakita ng mga positibong resulta gamit ang iba't ibang non-treponemal test at RPGA.

Ang pamamaraan ng ELISA ay maaaring gamitin sa isang dami na bersyon na may pagkalkula ng index ng positivity, o reaktibiti, na nagpapahintulot sa iyo na suriin ang antas ng mga antibodies sa sample.

Sa kasalukuyan sa Russia, ang paggamit ng enzyme immunoassay para sa diagnosis ng syphilis ay kinokontrol ng Order of the Ministry of Health ng Russian Federation No. 87 ng Marso 26, 2001 "Sa pagpapabuti ng serological diagnosis ng syphilis" (Appendix No. 1 " Staging screening at diagnostic test para sa syphilis”). Plano ng order na palitan ang RSC sa complex of seroreactions (SRC) ng ELISA at RPGA.

8. Mga pinagmulan at sanhi ng mga error sa panahon ng produksyon, false positive at false negatibong resulta

Ang enzyme immunoassay ay isang kumplikadong multi-stage na pag-aaral, kung saan kinakailangan na mahigpit na sundin ang lahat ng mga rekomendasyon ng mga tagagawa ng diagnostic kit, ang mga patakaran para sa pagsasaayos at pag-configure ng kagamitan na ginamit sa pag-aaral.

Ang pinagmulan ng mga error kapag nagsasagawa ng ELISA ay maaaring ang mga sumusunod na punto:

Pag-aaral sa reaksyon ng hyperlipidemic, hemolyzed blood serum o mga sample na may mga palatandaan ng paglaki ng bacterial;

Huwag magsanay sa pagyeyelo ng sample ng biological na materyal nang dalawa o higit pang beses, kung kinakailangan, ulitin ang pag-aaral, gumamit ng serum mula sa duplicate na test tube;

Paglabag sa mga tuntunin at kundisyon ng imbakan ng immunosorbent at solusyon sa paghuhugas; paggamit ng mga expired na test kit;

Paggamit ng mga bahagi ng reaksyon mula sa iba pang diagnostic kit;

Paglabag sa oras ng mga yugto ng reaksyon;

Pagpapatuyo ng mga balon ng immunological plate sa mga yugto ng reaksyon;

Muling paggamit ng mga plastic na pinggan (plastic tray) para sa paghahanda ng pinaghalong chromogen at substrate;

Pagkabigong sumunod sa dalas ng metrological control ng mga operating parameter ng mga device na ginamit (washer at spectrophotometer);

Paggamit ng kontaminadong kagamitan sa laboratoryo kapag nagse-set up ng mga reaksyon: flasks, graduated cylinders, test tubes, pipettes, pipette tip;

Hindi sapat na pagiging ganap sa pagsasagawa ng mga pagbabanto ng mga sample ng biological na materyal;

Mga error kapag naglalagay ng sample ng biological material sa kaukulang balon ng plato;

Mga error kapag naglilipat ng mga resulta ng pag-aaral sa log ng pagpaparehistro, protocol ng pag-aaral o form ng pagtugon.

Ang maingat na pagpapatupad ng mga rekomendasyon ng mga tagubilin para sa paggamit ng mga diagnostic test kit, regular na pag-verify ng katumpakan ng mga pipette dispenser at mga awtomatikong device, at ang paggamit ng mga panloob na positibo at negatibong kontrol ay ginagawang posible na makakuha ng mga resulta ng pagsusulit sa ELISA na may mataas na reproducibility.

9. Mga tampok, pakinabang at disadvantages

Ang ELISA ay isang moderno, promising na paraan para sa serodiagnosis ng syphilis dahil sa pagiging simple, reproducibility, at accessibility nito. Ang pagtukoy ng mga antibodies sa pamamagitan ng ELISA ay isang mainam na paraan ng diagnostic na angkop para sa sabay-sabay na pananaliksik Malaking numero mga sample. Dahil sa mga pakinabang nito, nakakuha ito ng katanyagan sa lahat ng mga bansa.

Ang teknolohiya ng pananaliksik ng ELISA ay nangangailangan ng pagsunod sa lahat ng mga rekomendasyon ng mga tagagawa ng komersyal na diagnostic test kit at pagiging ganap ng pamamaraan ng pananaliksik. Upang magsagawa ng pananaliksik sa ELISA, kinakailangan na bumili ng karagdagang mga espesyal na kagamitan. Ang pamamaraan ng pagtatanghal ng dula ay tumatagal ng higit sa matagal na panahon kumpara sa RMP, RPR at RPGA.

Ang pagkakaroon ng automation ng isang bilang ng mga yugto o ang buong proseso sa kabuuan ay nagbibigay-daan sa iyo na sabay na pag-aralan ang isang malaking bilang ng mga sample ng biological na materyal na may mataas na antas ng standardisasyon ng pag-aaral, pinaliit ang subjective na elemento sa pagsusuri ng mga resulta, at ang kakayahang mag-imbak ng mga nakapirming protocol ng pag-aaral, na nagbibigay-daan sa iyong i-archive ang data ng pag-aaral at i-access muli ang mga ito para sa pagsusuri sa nakaraan.

Mga kalamangan:

• Pinapagana ang pagkakaiba-iba at kabuuang pagpapasiya ng IgM at IgG antibodies sa causative agent ng syphilis.
• mataas na sensitivity at specificity na lumalapit sa 100%,
• reproducibility
• mga kakayahan sa automation

Ang mga bentahe ng ELISA ay kinabibilangan ng mataas na pagtitiyak (96-100%) at pagiging sensitibo (98-100%), na binanggit ng karamihan sa mga mananaliksik.

Ang pagkakaroon ng automation ng isang bilang ng mga yugto o ang buong proseso sa kabuuan ay nagpapahintulot sa iyo na sabay na pag-aralan ang isang daloy na may malaking bilang ng mga sample ng biological na materyal na may mataas na antas ng standardisasyon ng pag-aaral, na pinaliit ang subjective na elemento sa pagtatasa ng mga resulta. , ang kakayahang mag-imbak ng mga nakapirming protocol ng pananaliksik, na nagbibigay-daan sa iyong i-archive ang data ng pananaliksik at i-access muli ang mga ito para sa pagsusuri sa nakaraan .

Ang mga makabuluhang disadvantages ng mga manu-manong pamamaraan, kabilang ang pagtukoy ng mga antibodies sa T. pallidum antigens ng ELISA, ay:

~ posibleng pagkakamali ng tauhan sa panahon ng pananaliksik (pagmamasid, kapabayaan, paglabag sa teknolohiya);

~ ang imposibilidad ng kumpletong standardisasyon ng proseso ng pananaliksik sa manu-manong bersyon ng ELISA;

~ tumaas na panganib ng impeksyon ng mga tauhan.

10. Mga pagbabago sa pamamaraan

Kasama ang klasikal na hindi direktang ELISA, ang pamamaraan bitag ELISA. Ito ay iminungkahi noong 1989 ni O. E. Ijsselmudien et al. upang makita ang IgM antibodies sa Tr antigens. pallidum. Ang pamamaraan ay may mataas na pagtitiyak at pagiging sensitibo.

Ang mga purified antibodies sa class M na mga immunoglobulin ng tao ay na-sorbed sa ibabaw ng mga balon ng plato, at pagkatapos ng incubation ng test serum, lahat ng IgM ay nagbubuklod sa carrier. Ang pagkakaroon ng antigen-specific na Tr. sa mga nauugnay na IgM. pallidum ay nakita gamit ang Tr. pallidum conjugated sa enzyme.

Pinapayagan ka ng pamamaraang ito na makita ang mga antibodies hindi lamang sa klase ng IgM, kundi pati na rin Mga klase sa IgG, IgA. Upang gawin ito, ang mga balon ng mga plato ay na-sensitized na may affinity-purified antibodies ng isang partikular na klase laban sa mga immunoglobulin ng tao. Sa kasong ito, ang mga antibodies ng klase na ito ay nakuha mula sa suwero, at ang pagtuklas ng mga antibodies na partikular sa treponemal ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng mga ito sa isang conjugate na kumakatawan sa koneksyon ng treponemal antigen sa enzyme.

Ang paggamit ng isang decoy na bersyon ng enzyme immunoassay ay binabawasan ang panganib ng mga false-positive na reaksyon na namamagitan rheumatoid factor dugo, mga cross-reaksyon sa pagitan ng mga immunoglobulin ng mga klase M at G. Kapag sinusuri ang mga bagong silang, sa kasong ito, ang mga resulta ng maling positibong pagsusuri na nauugnay sa pagtuklas ng IgM na nakadirekta laban sa maternal antitreponemal IgG ay hindi rin kasama.

Natagpuan ng mga ELISA ang malawakang paggamit sa ibang bansa bilang mga opsyon. enzyme immune assay (EIA) at sistema ICE Syphilis. Sa huli, ang isang halo ng mga antibodies sa IgM at IgG, pati na rin ang tatlong recombinant na protina ng T. pallidum, ay na-sorbed sa mga selula ng plato. Ang mga positibong resulta ay sinusuri sa parehong sistema ng pagsubok nang doble para makagawa ng panghuling resulta.

Sa Russia, ang isang bilang ng mga sistema ng pagsubok ay binuo para sa serodiagnosis ng syphilis gamit ang pamamaraang ELISA na may mga domestic reagents. Ang mga system na ito ay may mataas na pagtitiyak at pagiging sensitibo.

Bilang karagdagan sa itaas, mayroon ding iba pang mga pagpipilian sa ELISA, kabilang ang mga nagbibigay-daan sa direktang pagtuklas ng pathogen sa dugo (direktang ELISA), dot-ELISA na may reaksyon sa nitrocellulose strips, ELISA na may capillary blood, pati na rin ang immunoblotting, o Western Blot, na may sabay-sabay na pagtuklas ng AT sa iba't ibang bahagi ng pathogen.

Ang isang modernong pinahusay na pagbabago ng ELISA ay immunoblotting.

ICA (immunochemiluminescence assay), ICL (immunochemiluminescence)

Sa pagbuo ng mga diagnostic ng laboratoryo sa konteksto ng modernisasyon ng pangangalagang pangkalusugan sa Russian Federation, ang automation ng pananaliksik sa laboratoryo ay pumasok sa pagsasanay ng mga laboratoryo, na ginagawang posible na i-standardize ang mga analytical na yugto ng pananaliksik. Nakakatulong ito na mapabuti ang kalidad ng diagnosis. Sa pagpapakilala ng automation, nagsimulang gumamit ng mga bagong high-tech na pamamaraan na may mataas na sensitivity at specificity, tulad ng chemiluminescence immunoassay (CLIA)

Ang Chemiluminescence ay ang proseso ng paglabas ng mga photon sa panahon ng paglipat ng mga elektronikong nasasabik na mga produkto ng mga oxidative na reaksiyong kemikal sa kanilang orihinal na estado ng enerhiya. Sa panahon ng reaksyon ng chemiluminescence, isang malaking halaga ng enerhiya ang inilabas, at ang dami ng ani ng ibinubuga na ilaw ay medyo mataas. Sa lahat ng non-isotopic na pamamaraan, ang chemiluminescence ay nagbibigay ng pinakamataas na sensitivity. Para sa mga immunometric na pamamaraan, ang sensitivity ng chemiluminescence ay mga order ng magnitude na mas malaki kaysa sa sensitivity ng radioimmunoassay.

Ang paraan ng immunochemiluminescence (ICL) ay kasalukuyang natagpuan ang paggamit nito sa pagsusuri ng mga tumor marker, autoimmune disease, diabetes, cardiac marker, hormones (thyroid, adrenal glands, female at male sex hormones), torch infection, viral hepatitis, at herpes virus.

Batay sa paraan ng immunochemiluminescence, maraming napaka-sensitibo at tiyak (98-100%) na mga sistema ng pagsubok ang binuo para sa pagsusuri ng syphilis, na pangunahing ginagamit sa ibang bansa.

Ginagamit ng pamamaraan ang nakuha pamamaraan ng genetic engineering recombinant lipoproteins, na kumpletong analogues ng T. pallidum antigens.

Batay sa mga resulta ng isang klinikal na pag-aaral, ang pamamaraan ng ICA ay nakatanggap ng pagkilala at inirerekomenda para sa paggamit sa laboratoryo ng diagnosis ng syphilis sa Russian Federation bilang isang screening at confirmatory test kung ang naaangkop na kagamitan ay magagamit sa mga laboratoryo. Noong 2012, isinama ang ICA bilang isang screening at confirmatory test para sa diagnosis ng syphilis sa Clinical Guidelines for the Management of Patients with Sexually Transmitted Infections at Urogenital Infections.

Kaya, ang paggamit ng high-tech na ICA, na naging bahagi ng pagsasanay ng parehong pandaigdigang at domestic na mga diagnostic ng laboratoryo kasama ang pagpapakilala ng automation, ay nagbibigay ng mga sumusunod na pakinabang:

• pag-aalis ng impluwensya ng mga subjective na kadahilanan sa analytical na yugto ng pag-aaral
• kaligtasan ng mga tauhan kapag nagsasagawa ng pananaliksik sa potensyal na nahawaang biological na materyal
• pagtaas ng bilis kung saan natatanggap ng pasyente ang mga resulta
• standardisasyon ng mga pag-aaral at kontrol sa kalidad ng mga pag-aaral
• naghahatid ng maaasahan, maaasahang mga resulta sa mga pasyente
• mataas na kalidad pananaliksik sa klinikal na laboratoryo.

Sa mga tuntunin ng pagiging sensitibo, ang pamamaraan ng ICA ay maihahambing sa paraan ng radioimmunoassay, at sa mga tuntunin ng kadalian ng pagpapatupad, kaligtasan para sa mga tauhan at maraming iba pang mga parameter, ito ay nalampasan ito.

Ang paraan ng ICA, na may mataas na sensitivity at specificity (98–100%), ay ginagawang posible quantification antas ng antibodies sa causative agent ng syphilis, ay maaaring gamitin upang kumpirmahin syphilitic impeksyon at screening. Mga limitasyon ng paggamit: hindi maaaring gamitin upang subaybayan ang pagiging epektibo ng therapy, maaaring magbigay ng maling positibong resulta.

Immunochromatography (ICH).

Ang mga pamamaraan para sa pag-detect ng mga antibodies na partikular sa treponeme batay sa mga pamamaraan ng immunochromatography (ICH) ay medyo bago para gamitin sa Russian Federation. Tulad ng sa pamamaraan ng ICA, ang mga recombinant na lipoprotein na nakuha ng mga pamamaraan ng genetic engineering (halimbawa: antigens Tp15, Tp17, Tp47) at ang biosynthetic peptide TmpA ay ginagamit bilang antigens. Ang mga nakalistang antigen ay ginagamit din sa iba't ibang kumbinasyon bilang bahagi ng immunosorbents sa ELISA at immunoblotting.

Ang pamamaraan ng ICG ay nagbibigay-daan sa iyo upang mabilis na matukoy ang nilalaman ng mga antibodies na partikular sa treponeme sa causative agent ng syphilis sa serum at buong sample ng dugo nang hindi gumagamit ng mga espesyal na kagamitan sa laboratoryo at ginagamit sa pagkakaloob ng pangunahing pangangalagang pangkalusugan, kabilang ang para sa mga indikasyon ng epidemiological.

Mga limitasyon ng paggamit: hindi maaaring gamitin upang subaybayan ang pagiging epektibo ng therapy, maaaring magbigay ng maling positibong resulta.

PBT (simpleng rapid bedside test)

Kamakailan lamang, sa serodiagnosis ng syphilis, isang direksyon ang nagsimulang bumuo ng tinatawag na simpleng rapid test (SRT), o bedside tests (Point-of-care - POC). Ang mga simpleng mabilis na pagsusuri sa gilid ng kama, o mga immunochromatographic na pagsusuri, ay nagbibigay-daan sa mabilis na pagtukoy ng nilalaman ng mga antibodies na partikular sa treponeme sa causative agent ng syphilis sa mga sample ng serum at buong dugo nang hindi gumagamit ng mga espesyal na kagamitan sa laboratoryo at maaaring magamit sa pangunahing pangangalaga sa kalusugan, kabilang ang para sa mga indikasyon ng epidemiological. Mga limitasyon ng paggamit: hindi maaaring gamitin upang subaybayan ang pagiging epektibo ng therapy, maaaring magbigay ng maling positibong resulta.

Ang mga pagsusuring ito ay batay sa immunochromatographic na pagpapasiya ng mga antibodies sa treponemal antigens ng Treponema pallidum at ginagawa sa mga piraso; sa kasong ito, parehong buong dugo at suwero ay maaaring gamitin (Herring A., Ballard R. et al, 2006). Ang format ng pagsubok ay nagpapahintulot sa pagsasaliksik na maisagawa sa kawalan ng mga espesyal na kagamitan at nang walang paggamit ng kuryente. Gayunpaman, dahil sa medyo mababang sensitivity at specificity, ang mga pagsubok na ito ay hindi pa malawakang ginagamit sa pagsasanay.

Immunoblotting (Western Blot)

Sa mga nagdaang taon, lumitaw ang mga pamamaraan ng pananaliksik na naglalayong makita at suriin ang nilalaman ng antibody sa bawat antigen Treponema pallidum nang hiwalay. Ang isa sa mga pamamaraang ito ay ang immunoblotting method (o blotting, immunoblotting, Western blot), na ginagamit upang matukoy ang IgG o IgM antibodies sa Treponema pallidum. Ang paraan ng immunoblotting ay isang pagbabago ng enzyme immunoassay - isang variant ng ELISA.

Immunoblotting ay isa sa mga pinaka makabagong pamamaraan serodiagnosis ng syphilis at aktibong ginagamit sa ibang bansa. Natanggap nito ang pangalan nito (“Western blotting”) bilang isang nakakatawang tugon sa mga pangalan ng mga pamamaraan para sa pagtukoy ng DNA (“Southern blotting”) at RNA (“Northern blotting”).

1. Kasaysayan ng pamamaraan

Immunoblotting (Western blot) ay ginagamit upang matukoy ang IgG o IgM antibodies sa treponema pallidum antigens (Herremans M. et al., 2007).

2. Klasikong immunoblot

Klasikong immunoblot(Western Blot Analysis) pinagsasama ang enzyme immunoassay at ang paggamit ng electrophoretic method. Ang mga protina ng antigen ng causative agent ng syphilis ay preliminarily na pinaghihiwalay ng electrophoresis at inilipat sa isang carrier - isang nitrocellulose membrane (strip). Ang paglipat na ito ay tinatawag na blotting. Pagkatapos ang carrier na ito na may mga hiwalay na tuldok (blots) ay ginagamot ng test serum at mga antibodies sa IgG o IgM, na may label na mga enzyme o radioactive substance. Ang pamamaraan ay nagsasangkot ng paggamit ng natural o recombinant na mga protina ng treponema.

Electrophoresis ay ang paghihiwalay ng mga sisingilin na compound batay sa kanilang kadaliang kumilos sa isang electrophoretic field. Kapag ang isang potensyal na pagkakaiba ay inilapat sa isang daluyan, ang mga molekulang may positibong sisingilin ay lumilipat patungo sa elektrod na may negatibong sisingilin, at ang mga molekula na may negatibong sisingilin ay lumilipat patungo sa positibong elektrod.

Karamihan sa mga globular na protina ay pinagsama-sama sa paraang ang karamihan sa mga naka-charge na grupo, lalo na ang mga hydrophilic, ay matatagpuan sa ibabaw ng protina, habang ang hindi naka-charge, ang mga hydrophobic residue ay naka-embed sa loob ng globule. Sa isang electric field, ang mga protina ay lumilipat ayon sa kanilang singil patungo sa oppositely charged electrode.

Ang electrophoretic na paghihiwalay ng mga protina ay isinasagawa sa isang synthetic gel medium batay sa polyacrylamide. Upang paghiwalayin ang mga protina ayon sa kanilang molekular na timbang bago ang electrophoresis pinaghalong protina preincubated sa pagkakaroon ng sodium dodecyl sulfate (SDS).

Ang mga detalyadong pag-aaral ng mga dayuhang siyentipiko na sina Weber at Osborn (1969) ay nagpakita na pagkatapos ng naturang paggamot, ang tanging kadahilanan na maaaring makaapekto sa kadaliang kumilos ng mga protina sa polyacrylamide gel (PAGE) ay ang laki ng protina, o sa halip ang molekular na timbang nito. Ginawa nitong posible na gamitin ang paraan ng PAGE electrophoresis sa pagkakaroon ng SDS para sa isang medyo tumpak na pagpapasiya ng molekular na timbang ng mga protina at peptides. Sa banyagang panitikan, ang pamamaraang ito ay tinatawag na SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis).

Profile ng reaktibiti sa klasikong pagsusuri sa WB na may mga natural na antigens (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis method). (1) - kontrolin ang positibong resulta, (2) - kontrolin ang negatibong resulta, (3-6) - mga klinikal na sample.

Sa mga pagsusuri para sa syphilis gamit ang pamamaraang ito, ang Treponema pallidum, na dati nang nadalisay at nawasak sa mga sangkap na bumubuo nito, ay sumasailalim sa electrophoresis sa isang polyacrylamide o agarose gel. Sa kasong ito, ang mga antigen na kasama sa komposisyon nito ay pinaghihiwalay ng molekular na timbang.

Pagkatapos, gamit ang vertical electrophoresis, ang mga antigen ay inililipat sa isang strip ng nitrocellulose, na ngayon ay naglalaman ng isang spectrum ng mga antigenic band na hindi nakikita ng mata, na katangian ng Treponema pallidum.

Kapag nagsasagawa ng pagsusuri, ang materyal ng pagsubok (serum, plasma ng dugo ng pasyente, atbp.) ay inilalapat sa isang nitrocellulose strip (strip). Kung mayroong mga tiyak na antibodies sa sample, pagkatapos ay sa panahon ng proseso ng pagpapapisa ng itlog ay malakas silang nagbubuklod sa mahigpit na kaukulang (komplementaryong) antigenic band at bumubuo ng isang "antigen-antibody" complex.

Matapos tanggalin ang mga hindi nakatali na immunoglobulin sa panahon ng paghuhugas ng strip, ang pagpapapisa ng itlog gamit ang isang conjugate - enzyme-labeled antibodies sa human immunoglobulins (antibodies sa human IgG o IgM) ay sumusunod, kung saan ang enzyme-labeled antibodies ay nakakabit sa mga umiiral na antigen-antibody complex sa ibabaw ng ang lamad.

Matapos alisin ang unbound conjugate sa panahon ng pagpapapisa ng itlog sa substrate solution, ang enzyme ay nakikipag-ugnayan sa substrate, na nagreresulta sa pagbuo ng isang reaksyon ng kulay - paglamlam ng mga lugar ng lamad (sa anyo ng mga guhitan) kung saan matatagpuan ang mga indibidwal na treponema pallidum antigens, mga antibodies kung saan ay nasa test serum. Ang intensity ng paglamlam ay depende sa dami ng nakagapos na antibodies mula sa suwero. Ang resulta ng reaksyon ay sinusuri nang biswal.

Ang pagkakaroon ng mga banda sa ilang mga lugar ng nitrocellulose plate ay nagpapatunay sa presensya sa nasubok na serum ng mga antibodies sa mahigpit na tinukoy na mga antigen ng Treponema pallidum.

Ang immunodeterminants 15, 5, 17, 44.5, 47 kD na tinutukoy gamit ang pamamaraang ito ay may diagnostic significance para sa syphilis. Ang immunoblotting ng Ig G ay katulad sa sensitivity at specificity sa RIF na may absorption (RIF abs). Ang Ig M immunoblotting ay maaaring magsilbing diagnostic test para sa congenital syphilis.

3. Immunoblot sa linear na immunoassay na format

Linear pagsusuri ng immunological(line immunoassay, LIA) ay nagbibigay-daan sa sabay-sabay na pagtukoy ng mga antibodies sa Treponema pallidum antigens sa serum o plasma ng tao. Ang mga antigen ay paunang inilapat sa mga test strip, na ibinibigay bilang bahagi ng komersyal na diagnostic kit.

Ang mga strip ay gawa sa nitrocellulose membrane, polyamide na may plastic backing o nylon membrane na may plastic backing. Sa panahon ng paggawa, maraming mga discrete antigens ang inilalagay sa test strip sa anyo ng mga hiwalay na antigenic na linya. Bilang karagdagan sa mga syphilis antigens na ito, apat pang control lines ang inilalapat sa bawat strip: streptavidin at control samples (3 +, 1 + at ± cut line).

Ang mga strip ay gumagamit ng mga artipisyal na antigen na nakuha sa pamamagitan ng mga pamamaraan ng genetic engineering - mga recombinant na protina o synthetic polypeptide constructs. Ang mga ito ay mga analogue ng surface antigens ng Treponema pallidum - TpN15, TpN17, TpN47 at TmpA na may molecular weights na 15, 17, 47 kDa at 44.5 (TmpA), kung saan kDa = kiloDaltons. Sa kanilang tulong, ang mga serum antibodies sa iba't ibang mga immunodominant na bahagi ng pathogen ay natutukoy.

Ang sample ng pagsubok ay inilalagay sa isang cuvette, kung saan inilalagay din ang indicator strip. Ang mga antibodies sa T. pallidum ay tinutukoy sa pamamagitan ng pagbubuklod sa mga antigen na inilapat sa mga test strip. Kung ang T. pallidum-specific antibodies ay naroroon sa sample, sila ay bumubuo ng mga bono na may natatanging antigen lineage. Kapag ang mga antibodies na nakapaloob sa test serum ay nakikipag-ugnayan sa mga discrete antigens ng T. pallidum na inilagay sa test strip, isang antigen-antibody complex ay nabuo sa anyo ng mga visually detectable color bands.

Kapag isinasaalang-alang ang mga resulta ng immunoblotting, ang reaktibiti ng suwero sa bawat isa sa mga antigens ay tinasa nang hiwalay. Ang isang kabuuang positibong tugon ay ibinibigay kapag ang isang resulta ay nakuha nang sabay-sabay sa dalawa o tatlo sa mga ipinakitang antigens.

Ang mga pamamaraan ng pananaliksik ay isinasagawa nang manu-mano o sa isang espesyal na analyzer, na may interpretasyon ng mga resulta gamit ang isang dalubhasang programa sa computer para sa mga nakakahawang sakit.

Dahil sa mataas na antas ng purification ng recombinant antigens at ang sabay-sabay na pagtuklas ng mga antibodies sa pinaka-immunogenic determinants ng causative agent ng syphilis, ang pamamaraan ay may mataas na sensitivity at specificity.

4. Accounting para sa mga resulta

Upang mabasa ang intensity ng paglamlam ng mga antigenic band sa mga piraso, ang mga photometer ay binuo, ang pagpapatakbo nito ay batay sa pagmuni-muni ng signal, na hindi kasama pansariling pagtatasa at nagbibigay ng potensyal para sa automation.

5. Sa anong mga panahon ng karamdaman ito ay mas mahusay na gamitin

Ang mga pagsusuri gamit ang immunoblotting ay maaaring makakita ng mga partikular na antibodies sa Treponema pallidum antigens sa napakaagang yugto ng sakit. Ang pinakamahalagang antibodies sa diagnosis ng syphilis ay mga antibodies sa Treponema pallidum antigens TpN15, TpN17, TmpA at TpN47. Ang mga antigen na ito ay mga protina ng lamad na may mga molekular na timbang na 15, 17, 44.5 at 47 kDa, ayon sa pagkakabanggit.

Kapag ang Treponema pallidum ay ipinakilala sa katawan ng tao, ang mga antisyphilitic antibodies ay lilitaw sa ganitong pagkakasunud-sunod: una, ang isang immune response sa TpN17 antigens ay bubuo, pagkatapos ay sa TpN47, pagkatapos ng TpN15 at mamaya sa lahat ng TmpA. Kapag isinasaalang-alang ang mga resulta ng pagsubok, ang serum reaktibiti sa bawat isa sa kanila ay tinasa nang hiwalay. Halimbawa, kapag ang isang linear blot ay nagpapakita ng reaktibiti lamang sa mga linya ng antigen na TpN17 at TpN47, nangangahulugan ito na ang sakit ay nasa maagang yugto. Ang mas maraming mga linya ng antigen ay nagiging reaktibo, mas lumalaki ang impeksiyon. Kapag ginagamot ang syphilis, nagbabago ang pattern ng reaktibiti sa pagsusulit na ito.

Ang pagpapasiya ng IgM sa mga protina na may molekular na timbang na 15.17, 41, 47 kDa ay ginagawang posible na makilala ang 29.2% ng mga pasyente na may pangalawang syphilis, 12.5% ​​​​may maagang latent syphilis at 8.0% na may seroresistance. Ang paghahanap para sa IgG sa parehong mga molekula ay nailalarawan sa pamamagitan ng sensitivity ng 61.6% para sa seroresistance at 100% para sa pangalawa at maagang nakatagong syphilis.

6. Sensitivity at specificity

Ayon sa panitikan, ang sensitivity at specificity ng pagsubok ay napakataas - 99.6-100 at 99.3-99.5%, ayon sa pagkakabanggit. Sa klasikal na pamamaraan, ito ay nakamit sa pamamagitan ng electrophoretic separation ng mga protina, glyco- at lipoproteins at ang pinakamataas na pagtitiyak ng pag-detect ng immune sera o monoclonal antibodies. Sa ilalim ng pinakamainam na mga kondisyon, ang immunoblotting ay maaaring makakita ng antigen sa mga dami na mas mababa sa 1 ng sa dami ng pagsubok.

Ang sensitivity ng linear blot ay 99.6% din, at ang specificity ay nasa pagitan ng 99.3% at 99.5%.

Ayon sa mga eksperto, ang immunoblotting na may recombinant na highly specific na antigens ay katulad ng sensitivity at specificity sa RIF-abs.

Ayon sa data ng dayuhang literatura at mga resulta ng isang pag-aaral sa TsNIKVI, ang immunoblotting na paraan ay may mataas na sensitivity (98.8-100%) at pagtitiyak (97.1-100%) para sa pag-diagnose ng syphilis.

7. Saklaw ng aplikasyon ng pamamaraan

Ang immunoblotting (immunoblot) ay isang napakaspesipiko at napakasensitibong paraan ng sanggunian. Ang mataas na sensitivity at specificity ay nagpapahintulot sa paraang ito na maisaalang-alang bilang confirmatory test para sa syphilis. Ang pamamaraan ay maaaring gamitin upang kumpirmahin ang diagnosis, gayundin sa mga kaso kung saan ang iba pang mga pagsusuri sa treponemal ay nagbibigay ng kaduda-dudang at magkasalungat na mga resulta. Gamit ang immunoblotting, maaari mong kumpirmahin ang diagnosis sa mga pasyente na may positibo o hindi tiyak na mga resulta ng pagsubok, kabilang ang mga nakuha gamit ang RPGA o ELISA.

8. Mga pinagmulan at sanhi ng mga error sa panahon ng produksyon, false positive at false negatibong resulta

Ang mga maling positibong resulta ay napakabihirang. Ang mga maling-negatibong resulta ay bihira din at naoobserbahan sa mga pasyenteng may immunodeficiencies - mas madalas sa nahawaan ng HIV at sa epekto ng isang diagnostic na "window" dahil sa isang pagkaantala sa synthesis ng mga antibodies, pati na rin sa mga error sa yugto ng diagnosis.

Ang paggamit ng mga modernong sistema ng pagsubok ay nagdidikta ng mahigpit na pagsunod sa lahat ng mga kinakailangan para sa parehong materyal at ang pagpapatupad ng reaksyon. Karaniwan, ang pinagmulan ng mga error ay isang paglabag sa pagkakasunud-sunod at teknolohiya ng pag-aaral (lalo na para sa klasikong Western blot), at hindi pagsunod sa mga rekomendasyon ng mga tagagawa ng test kit. . Ang mga error ay maaari ding mangyari sa panahon ng pagkolekta, paghahatid, pag-iimbak ng mga sample ng serum, at sa panahon ng pagsubok. Bilang karagdagan sa mga nasirang sample, kasama sa iba pang posibleng dahilan ang paggamit ng mga expired na test kit, pati na rin ang mga pagkakamali sa pagsusuri ng mga resulta ng pag-aaral.

9. Mga tampok, pakinabang at disadvantages

Ang pagiging natatangi ng immunoblot ay nakasalalay sa mataas na nilalaman ng impormasyon at pagiging maaasahan ng mga resulta.

Ang pagsubok ay hindi nangangailangan ng mataas na purified antigens, reference o control sera. Ang pagkakakilanlan ng target na antibody ay batay sa molekular na timbang ng protina kung saan ang mga antibodies mula sa serum ng pasyente ay tumutugon. Sa isang reaksyon, ang antibody na nagbubuklod sa maraming antigens ay maaaring makita, na ang bawat isa ay maaaring tiyak na mailalarawan. Dahil dito, ang immunoblotting ay may ilang mga pakinabang sa iba pang mga pamamaraan para sa pag-detect ng mga antibodies, ang mga resulta nito ay nakasalalay sa standardisasyon, sensitivity, kalidad ng substrate, kawalang-tatag o insolubility ng ilang mga antigens.

Ang pamamaraan ay madaling muling gawin, medyo simple upang maisagawa at bigyang-kahulugan ang mga resulta, ginagawang posible upang matukoy ang spectrum ng mga antibodies sa ilang T. pallidum antigens nang sabay-sabay at suriin ang kontribusyon ng mga antibodies ng iba't ibang mga pagtitiyak sa pangkalahatang tugon.

Ang paggamit ng highly purified recombinant at peptide antigens ay nagpapaliit sa nonspecific serum reactivity. Ang paggamit ng pamamaraan ay ginagawang posible upang maiwasan ang labor-intensive at subjective na mga pamamaraan na nagdudulot ng panganib sa mananaliksik (inoculation ng G. pallidum strains, nagtatrabaho sa pathogenic T. pallidum kapag nagtatanghal ng isang reaksyon). Tinutukoy nito ang kagustuhan ng paraan ng immunoblotting kaysa sa iba pang mga pagsusuri sa treponemal (RIF at lalo na ang RIBT) para sa pag-diagnose ng syphilis.

10. Mga pagbabago sa pamamaraan

Mayroong ilang mga komersyal na sistema ng pagsubok batay sa pamamaraang ito. Ang ilan sa mga ito ay ginawa sa format Western blot, binubuo ng mga strips kung saan inililipat ang mga bahagi ng protina ng T. pallidum, na dati ay pinaghihiwalay ng electrophoresis sa isang polyacrylamide gel.

Ang iba ay nasa format linear blot, binubuo ng mga strips kung saan ang mga recombinant at synthetic polypeptides ay na-sorbed sa anyo ng mga discrete na linya - mga analog ng mga antigen sa ibabaw ng T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 at TmpA.

Ang mga resulta ng Western blot ay mas mahirap bigyang-kahulugan dahil ang mga strip ay nagpapakita ng malawak na iba't ibang mga antibodies, na marami sa mga ito ay partikular sa grupo. Sa kaibahan, ang interpretasyon ng mga resulta ng line blot ay diretso; Bilang karagdagan, ang mga karagdagang linya ng kontrol na inilapat sa strip ay nagbibigay-daan sa semi-quantitative na pagtatasa ng antas ng mga antibodies sa apat na T. pallidum antigens.

teknolohiya ng xMAP

Ang xMAP ay isang modernong teknolohiya na nagbibigay-daan para sa multiparametric na pag-aaral sa pamamagitan ng sabay-sabay na pagtuklas ng maramihang mga analyte sa isang biological sample. Ang mga may kulay na microsphere na pinahiran ng mga capture reagents (oligonucleotides, antibodies, antigens) ay ginagamit bilang solid phase.

Ang sample ng pagsubok ay idinagdag sa solusyon na naglalaman ng mga microsphere. Ang mga analyte na nakita sa sample ay nakatali sa kaukulang microsphere, pagkatapos kung saan ang isang detection agent (detection antibodies, fluorescent label) ay idinagdag sa solusyon. Upang matukoy ang analyte na tinutukoy, isang sistema ng dalawang laser ang ginagamit, na nagbibigay-daan para sa parehong isang husay na pagtatasa ng pagkakaroon ng analyte sa sample (para dito, isang pulang laser ang ginagamit, pag-uuri ng mga microsphere ayon sa kulay), at isang quantitative. pagtatasa ng nilalaman ng analyte sa sample (para dito, isang berdeng laser ang ginagamit).

Ang pag-aaral ay awtomatikong isinasagawa sa mga analyzer tulad ng Bio-Plex 200 (bio-rad), Bio-Plex2200 (bio-rad), Luminex100 (luminex), Luminex200 (luminex) na nilagyan ng software.

Ang pagiging produktibo ng teknolohiya ng xMAP ay higit na lumampas sa classical enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) na may mas maliit na volume ng biomaterial.

Ang teknolohiyang xMAP, na may mataas na analytical sensitivity, ay kasalukuyang ginagamit upang malutas ang isang malawak na hanay ng mga klinikal na problema. Sa tulong nito, sa isang sample ng biological na materyal, ang sabay-sabay na pagtuklas ng mga kilalang tumor marker, cardiac marker, marker ng acute phase at diabetes mellitus, isang malawak na hanay ng mga cytokine, chemokines, at growth factor ay isinasagawa. Ang sabay-sabay na pagtuklas ng maraming analytes sa isang biological sample ay maaaring makabuluhang bawasan ang oras ng pagsusuri ng pasyente. Sa ngayon, ang isang bilang ng mga sistema ng pagsubok ay binuo upang makita ang mga antibodies sa mga pathogen ng STI, sa partikular na impeksyon sa syphilitic, gamit ang xMAP method.

OSPITAL"Sa Samotechnaya"

Reception sa pamamagitan ng appointment! Sabado Linggo.

Tinutukoy ang antilipid antibodies (reagins). Ang mga syphilitic antigens ay idinagdag sa serum ng dugo ng pasyente, na bumubuo ng isang immune complex na may reains na may kakayahang mag-adsorbing at mag-binding complement. Kung ang gayong kumplikado ay nabuo, kung gayon ang pagkasira ng mga pulang selula ng dugo (hemolysis) ay hindi mangyayari, at sila ay namuo (positibong reaksyon). Kung walang mga reagin sa suwero ng pasyente, pagkatapos ay nangyayari ang hemolysis at ang mga pulang selula ng dugo ay hindi namuo (negatibong reaksyon).

RPR (Rapid Plasma Reagin)

O ang reaksyon ng microprecipitation na may cardiolipin antigen ay isang paraan ng screening para sa pag-diagnose ng syphilis. Ang reaksyong ito, sa isang tiyak na lawak, ay maaaring ituring bilang isang mas modernong pagbabago ng reaksyon ng Wasserman. Ang pangunahing indikasyon para sa pagsusulit na ito ay ang paunang pagsusuri para sa syphilis, medikal na eksaminasyon, at pagsubaybay sa pagiging epektibo ng paggamot. Ang isang positibong resulta ay nangangailangan ng iba, mas tumpak na mga pagsusuri upang kumpirmahin ang diagnosis.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Isa sa mga pinaka-maaasahan na pamamaraan para sa pagsusuri sa laboratoryo ng syphilis. Ang prinsipyo nito ay ang pagkakakilanlan ng isang tiyak na antigen-antibody complex, na nabuo sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng syphilitic antigens na hinihigop sa isang solidong carrier na may mga antibodies mula sa serum ng dugo na sinusuri. Sa kasalukuyan, ang pinakakaraniwan ay ang hindi direktang bersyon ng ELISA, ang huling yugto kung saan ay gumagamit ng mga antibodies sa mga immunoglobulin ng tao na pinagsama sa malunggay peroxidase o iba pang mga marker ng enzyme. Ang pangkulay ng mga huling produkto ng reaksyong ito ay sinusukat at depende sa dami ng serum antibodies na nakatali.

Immunofluorescence reaction (RIF)

Sa panahon ng mga reaksyon ng immunofluorescence Tinutukoy ng (RIF) ang intensity ng glow ng maputlang treponema sa paghahanda, na nangyayari lamang sa pagkakaroon ng mga antitreponemal antibodies sa serum ng dugo. Ang reaksyon ay isinasagawa gamit ang suwero sa iba't ibang mga dilution (10 at 200 beses).

Treponema pallidum immobilization reaction (TPI)

Ang pinaka-tiyak na pagsusuri sa diagnostic para sa syphilis. Sa serum ng dugo ng mga pasyente, ang mga antibodies na partikular sa video (immobilsins) ay tinutukoy, na nagpapawalang-bisa sa Treponema pallidum sa pagkakaroon ng pandagdag. Gamit ang isang mikroskopyo, kinakalkula ang proporsyon ng mga treponema na nawalan ng kadaliang kumilos (immobilized). Ang dugo ay sinusuri gamit ang paraan ng RIBT nang hindi mas maaga kaysa sa 2 linggo pagkatapos ng pag-inom ng mga antibiotic at iba pang mga gamot.

Ang mga pagsusuri sa dugo gamit ang mga pamamaraan ng RIBT at RIF ay isinasagawa upang masuri ang nakatagong syphilis. Ang RIF (10-fold dilution of serum) ay ginagawang posible na gumawa ng diagnosis kahit na sa mga pasyente na kung saan ang pag-aaral ng Treponema pallidum ay hindi nakita.

Passive hemagglutination reaction (RPHA)

Kumbinasyon ng maputlang treponema blood serum na may mga erythrocytes ng tupa na naproseso ng mga espesyal na pamamaraan. Kung ang causative agent ng syphilis ay naroroon sa serum ng dugo, ang agglutination (gluing at kasunod na sedimentation) ng mga pulang selula ng dugo ay nangyayari. Ang mga reagents ay idinagdag sa mga balon ng mga espesyal na plato, at ang resulta ng reaksyon ay hinuhusgahan ng pangkulay. Ang pulang selula ng dugo agglutinate ay madilim na pula sa kulay at may isang batik o singsing na hugis.

SA network ng mga klinika na "MedCenterService" Maaari kang mag-abuloy ng dugo para sa syphilis gamit ang alinman sa mga pamamaraan na inilarawan sa itaas. Ang dugo para sa pagsusuri ay dapat kunin mula sa isang ugat, sa walang laman na tiyan (hindi bababa sa 4 na oras pagkatapos ng huling pagkain). Hindi inirerekomenda na mag-abuloy ng dugo pagkatapos uminom ng alak, gamot, o sa panahon ng regla.
Kung mayroon kang hinala na maaaring nahawa ka ng syphilis o nagpaplano ng pagbubuntis, huwag ipagpaliban ang pagpapasuri, pumunta sa klinika "MedCenterService".

RIF, RIBT, RPGA

RIF - reaksyon ng immunofluorescence- pagsubok ng treponemal. Ito ay isa sa mga pinaka-sensitibong pagsusuri para sa syphilis. Nagiging positibo ang RIF 10-20 araw pagkatapos ng impeksyon, na inuuri ito bilang isang paraan para sa maagang pagtuklas ng syphilis.

Mga indikasyon para sa pagsasagawa ng RIF:

• Ginagawa ang RIF sa mga taong may sintomas ng syphilis, na may negatibong reaksyon - RMP, RV;
• bilang isang differential reaction sa mga indibidwal na may positibong RW reactions, microreactions at kawalan ng mga sintomas;
• sa mga buntis na kababaihan sa kawalan ng mga klinikal na pagpapakita at isang kasaysayan ng syphilis.

Pamamaraan para sa pagsasagawa ng RIF:

• Kapag isinasagawa ang reaksyon, ang dugo ng kuneho na nahawaan ng Treponema pallidum (ang causative agent ng syphilis) at fluorescent (luminous) na serum ay idinagdag sa serum ng pasyente. Ang pag-aaral ay binubuo ng pagmamasid sa glow ng mga complex sa ilalim ng fluorescent microscope. Ang mga resulta ng reaksyon ay binibigyang kahulugan depende sa intensity ng glow mula 1+ hanggang 4+, na nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng syphilis. Kawalan ng glow - ang isang negatibong resulta ng RIF ay nangangahulugan na ang taong sinusuri ay malusog. Ang mga maling resulta ng pagsusuri ay napakabihirang sa panahon ng mga sistematikong proseso, pagbubuntis, atbp.
• Ang reaksyon ay isinasagawa sa mga pagbabago RIF-200 at RIF-avs (pagsipsip).
• Ang sensitivity ng reaksyon para sa pangunahing syphilis ay tungkol sa 85%
• na may tertiary syphilis - 98-100%.

Ang negatibiti ng RIF ay nangyayari sa loob ng ilang taon pagkatapos ng paggamot ng syphilis. Pagkatapos ng antisyphilitic therapy, ang pagsubaybay sa mga indicator sa paglipas ng panahon ay kinakailangan.

RIBT- Treponema pallidum immobilization reaction ay ang pinakaespesipikong pagsusuri sa dugo para sa syphilis. Ang RIBT ay isang mataas na kalidad, mahal na pagsusuri ng dugo, na maaaring isagawa ng mga laboratoryo na may mahusay na kagamitan. Ang RIBT ay isang pangunahing reaksyon para sa mga nakatagong anyo ng syphilis, neurosyphilis, at viscerosyphilis. Nagbibigay-daan sa iyo na ibahin ang mga maling positibong reaksyon mula sa totoong syphilis.

Ang reaksyon ay batay sa immobilization (immobilization) ng syphilis pathogen na may mga antibodies na partikular sa species. Sa pamamagitan ng mikroskopikong pagsusuri, ang resulta ng reaksyon ay binabasa: 0-20% - negatibo, 21-30% - nagdududa, 31-50% - mahina positibo, 51-100% - positibong reaksyon. Iyon ay, ang mga positibong resulta para sa syphilis ay kinabibilangan ng mga kung saan ang RIBT ay higit sa 50%. Sa syphilis, ang RIBT ay nagiging positibo nang medyo mabagal: sa pangunahing panahon ng syphilis ito ay negatibo pa rin, sa pangalawang sariwang panahon ito ay positibo sa 50% ng mga kaso, sa pangalawang panahon ng pagbabalik ay positibo sa 90-100%, sa tertiary period ito ay positibo sa 99-100%.

Ang negatibiti ng RIBT ay isinagawa sa loob ng mga dekada, samakatuwid, hindi lehitimong gamitin ito bilang isang pamantayan para sa pagiging maaasahan ng lunas; gayunpaman, ang dynamic na pagmamasid pagkatapos ng anti-syphilitic na paggamot ay kinakailangan.

Maipapayo na isagawa ang reaksyon ng RIBT nang hindi mas maaga kaysa sa 30 araw pagkatapos ng pagtatapos ng paggamot. RPHA - passive hemagglutination reaction - tumutukoy sa treponemal tests at isinasagawa kasama ng non-treponemal tests. Ginagamit upang kumpirmahin ang diagnosis ng syphilis sa anumang yugto.

Maipapayo na isagawa ang reaksyon 4 na linggo pagkatapos ng pinaghihinalaang impeksyon. Kapag isinasagawa ang reaksyon, ang isang gamot na inihanda mula sa mga pulang selula ng dugo ng pinagmulan ng hayop, na sensitized sa antigen ng Treponema pallidum, ang causative agent ng syphilis, ay idinagdag sa serum ng dugo ng pasyente.

Ang kakanyahan ng reaksyon ng RPHA ay gluing (agglutination) sa pagkakaroon ng mga antibodies sa treponema at ang pagbuo ng isang agglutinate - isang figure na sinusunod ng isang katulong sa laboratoryo. Ang reaksyon ay tinasa ng bilang ng +: 4+ - malakas na positibong resulta, 3+ - positibo, 2+ - mahinang positibo, 1+ - nagdududa, - - negatibong resulta. Kung ang reaksyon ay positibo, ang isang quantitative assessment ay isinasagawa upang matukoy ang konsentrasyon (titer) ng mga antibodies. Habang lumalaki ang syphilis, patuloy na tumataas ang titer ng antibody.

Ang RPGA ay nananatiling positibo sa mga dekada pagkatapos ng paggamot sa syphilis, at samakatuwid ay hindi maaaring gamitin bilang isang pamantayan para sa katiyakan ng paggaling. Gayunpaman, kinakailangan na obserbahan ang titer ng RPHA antibodies sa paglipas ng panahon.

Ang pamamaraan ay lubos na sensitibo. Maaaring false positive ang mga resulta ng RPGA. Ang mga sakit sa connective tissue, ilang impeksyon, atbp. ay maaaring humantong sa mga resulta ng pagsusuri.

Ang pagsusuri sa laboratoryo ng plasma ng dugo ay naging at nananatiling pangunahing paraan upang masuri at masubaybayan ang syphilis.

Ang sakit na ito ay hindi permanente, at ang mga nakatagong anyo ay karaniwang hindi nakikita sa labas. Kabilang sa iba't ibang mga pamamaraan ng serological, ang pinaka maaasahang mga resulta ay ibinibigay ng Pagsusuri ng RIF para sa syphilis.

REEF ay isang immunofluorescence reaksyon. Sa mga tuntunin ng mga kakayahan sa diagnostic, ang pamamaraan na ito ay nabibilang sa mga hindi direktang partikular na pagsubok. Iyon ay, ang pathogen mismo ay hindi matukoy sa tulong nito. Ngunit batay sa hindi direktang katibayan, ang isa ay maaaring gumawa ng isang makatwirang konklusyon tungkol sa pagkakaroon o kawalan ng Treponema pallidum sa katawan.

Ang pananaliksik ay nangangailangan ng:

• Sampol ng dugo ng pasyente. Bilang isang patakaran, ginagamit ang venous blood, ngunit may mga opsyon para sa pagsasagawa ng RIF na may capillary blood mula sa isang daliri.
• Karaniwan, ginawa sa industriya, treponemal antigen. Ito ay mga espesyal na protina ng spirochete na nagsisilbing "mga anchor" para sa mga antibodies sa Treponema pallidum mula sa suwero ng pasyente.
• Standard na may mga immunoglobulin na protina na nagbubuklod sa mga antibodies sa dugo ng pasyente.
• Luminescence mikroskopyo.

Ang reaksyong ito ay may napakataas na pagtitiyak at pagiging sensitibo. Ngunit hindi ito mura at hindi ganoon kadaling i-install. Samakatuwid, ito ay pangunahing ginagamit upang i-verify ang diagnosis sa mga kaso na nagdududa at false-positive.

Paano isinasagawa ang RIF diagnosis ng syphilis?

Ang algorithm para sa pag-set up ng isang immunofluorescence reaksyon ay binubuo ng ilang mga hakbang. Dahil sa pagiging kumplikado ng diskarteng ito, hindi ito angkop para sa mass screening na pag-aaral.

Ang mga hakbang mismo ay:

• Ang isang sample ng dugo/plasma na nakuha mula sa pasyente ay pinoproseso sa isang glass slide na naglalaman ng pinatuyong treponemal antigen. Ito ay nakuha mula sa rabbit testicular tissue na nahawaan ng Nichols strain spirochete.
• Pagkatapos maghintay ng ilang minuto, ang baso ay hugasan ng distilled water.
• Ang nahugasan na sample ay ginagamot ng isang espesyal na pang-industriyang serum na naglalaman ng sarili nitong mga antibodies sa mga anti-treponemal antibodies ng tao. Ang mga immunoglobulin ng serum na ito ay pre-label na may isang espesyal na sangkap na kumikinang na dilaw-berde sa ilalim ng ultraviolet light.
• Sinundan ito ng muling pagbabanlaw.
• Ang slide ay inilalagay sa ilalim ng fluorescence microscope at sinusuri.

Kung ang isang technician ng laboratoryo ay nakakita ng isang katangian na kumikinang sa mikroskopyo na eyepiece, nangangahulugan ito na mayroong mga antibodies sa Treponema pallidum sa dugo ng pasyente. Nakipag-ugnayan sila sa uri ng antigen. At ang mga immunoglobulin na may label na phosphor mula sa standardized industrial serum ay nag-react sa kanila, sa turn.

Pagsusuri para sa syphilis RIF: pagiging maaasahan ng mga resulta

Sa serological diagnosis ng syphilis, napakahalaga na makakuha ng maaasahan at tumpak na resulta.

Upang mapahusay ang kalidad ng data, may ilang mga pagkilos na ginagawa:

• Ang test serum ay diluted nang 200 beses (1:200) upang maiwasan ang mga false-positive na reaksyon. Pagkatapos ay sinasabi nila na ito ay isinasagawa pagsubok para sa syphilis RIF 200.
• Sa isa pang pagpipilian, kapag ang pagtunaw ng serum 1: 5, isang espesyal na sumisipsip ay ginagamit din, na nangongolekta ng "dagdag" na mga antibodies upang hindi nila masira ang mga resulta.

Ang laki ng mga treponema ay naglalaro din sa mga kamay ng mga mananaliksik. Ang malalaking microbial body ng spirochetes ay malinaw na nakikita sa ilalim ng fluorescence microscopy. Kung ang mga protina na may label na phosphor mula sa serum ay "kumapit" sa kanila. Ang paggamit ng isang standardized antigen at serum ay nagbibigay-daan sa amin upang i-maximize ang sensitivity at specificity ng RIF sa diagnosis ng syphilis.

Pribadong opsyon sa pagsusuri ng RIF: RIF absorption

Ang isa sa mga alternatibong pamamaraan ay tinatawag na RIF-Abs. Ito ay naiiba sa karaniwang paraan sa pamamagitan ng mababang pagbabanto ng test serum - 1:5 kumpara sa 1:200, gaya ng dati.

Ang puro sample ay naglalaman ng maraming aktibong molekula ng protina.

Upang maiwasan at madagdagan ang sensitivity, ang serum ay ginagamot ng isang espesyal na sumisipsip na ginawa mula sa mga fragment ng syphilitic spirochetes. Kinokolekta ng sorbent ang sobrang aktibong antibodies at pagkatapos ay ginagamot ang sample ng isang pang-industriyang serum na may label na phosphor. Salamat sa paunang paghahanda na ito, ang lahat ng mga hindi kinakailangang molekula na maaaring makaapekto sa mga resulta ng pagsubok ay tinanggal.

Ito ay inilalagay ayon sa mga sumusunod na indikasyon:

• Positibo laban sa background ng klinikal na kagalingan at walang kasaysayan ng mga panganib sa impeksyon.
• Positibong RV sa mga pasyenteng dumaranas ng mga malalang sakit.
• Negatibong RV kapag lumitaw ang mga sintomas na kahina-hinala para sa syphilis.

Ang mga unang positibong resulta ay lilitaw na sa ika-15-16 na araw mula sa sandali ng impeksyon. Kung ang reaksyon ay nagbabago mula sa positibo patungo sa negatibo, ito ay nagpapahiwatig ng kumpletong lunas para sa syphilis. Ang posibilidad ng isang maling positibong resulta ay mas mababa sa 0.4%.

Ang sitwasyong ito ay maaaring mangyari kapag sinusuri ang mga pasyente ng kanser, alkoholiko, mga buntis na kababaihan at mga taong dumaranas ng mga sakit sa immune.

Ang isang tiyak na proporsyon ay dahil sa mga teknikal na pagkakamali, dahil ang produksyon ay medyo kumplikado. May mga oras na kinakailangan upang makilala ang isang congenital pathology mula sa isang nakuha. Magagawa ito sa pamamagitan ng paghahanap ng iba't ibang uri ng antibodies sa dugo ng pasyente.

Ang mga antibodies sa syphilis class M (IgM) ay lilitaw kaagad pagkatapos ng impeksyon at mas mabilis kaysa sa IgG. Binibigyang-daan kang makilala ang mga ito pagsusuri para sa syphilis RIF absorption IgM. Kung ang mga resulta ng reaksyong ito ay positibo, maaari nating pag-usapan ang tungkol sa kamakailang impeksyon. Sa ganitong paraan, ang mga kaso ng reinfection ay maaaring makilala mula sa relapse o impeksyon ng isang bata pagkatapos ng panganganak ay maaaring makita.

Batay sa mga resulta ng pamamaraan ng pagsusuri ng RIF na ito, ang isang konklusyon ay iginuhit din tungkol sa pagiging epektibo ng paggamot ng maagang syphilis.

Kung pinaghihinalaan mo ang syphilis, makipag-ugnayan sa isang bihasang venereologist.

tahanan" Pagsusuri » Ano ang mga titer para sa syphilis? Pagsusuri para sa syphilis reef

Ang mga pagsusuri sa RIF at RIBT ay mga pagsubok para sa pagtuklas ng syphilis.

Ang mga pag-aaral na ito ay tumutukoy sa mga partikular na pagsubok sa treponemal.

Ano ang mga pagsubok sa RIBT at RIF?

Kapag ang RIBT analysis ay inireseta, ang pasyente ay may tanong, ano ito?

Ang RIBT ay isang immobilization reaction ng Treponema pallidum.

Ang pagsusuri na ito ay ang pinaka tiyak na uri ng pagpapasiya ng syphilis.

Sa panahon ng pag-aaral, ang mga antibodies - immobilsins - ay tinutukoy sa serum ng dugo. Ang ganitong mga protina ay nag-aalis ng Treponema pallidum ng motility. Nagbibigay-daan ito para sa isang quantitative count ng pathogen.

Mahalaga! Kapag ang RIBT test ay inireseta, maaari itong kunin 2 linggo lamang pagkatapos ihinto ang antibiotics.

Ang ibig sabihin ng RIF ay "immunofluorescence reaction."

Sinusuri ng pagsusuri na ito ang fluorescence ng syphilis pathogens.

Ang reaksyong ito ay nangyayari kapag ang mga antibodies sa Treponema pallidum ay naroroon sa serum ng dugo ng pasyente.

Ang dugo ay ibinibigay para sa RIBT at RIF upang makita ang nakatagong syphilis.

Ang reaksyon ng immunofluorescence ay ginagawang posible na gumawa ng diagnosis, kahit na ang treponema pallidum ay hindi nakita sa dugo. Nangangailangan ito ng pag-aaral na may sampung beses na pagbabanto ng suwero.

Mahalaga! Ang reaksyon ng RIBT ay hindi epektibo para sa pagtukoy ng maagang syphilis.

Ito ay dahil sa ang katunayan na ang mga immobilin ay lumilitaw lamang 1.5 - 2 buwan pagkatapos ng impeksyon.

Ang dugo ay ibinibigay para sa RIBT para sa mga sumusunod na indikasyon.

• Diagnosis ng latent syphilis, kabilang sa mga buntis na kababaihan.
• Naka-on ang syphilis mga huling yugto mga sakit.
• Pagsubaybay sa paggamot ng syphilis.
• Positibong reaksyon ng Wasserman sa kawalan ng mga klinikal na pagpapakita.

RIBT at RIF pagkatapos ng paggamot

Ang RIF at RIBT, kung gumaling ang syphilis, ay maaaring manatiling positibo. Ito ay dahil sa ang katunayan na ang mga antibodies sa Treponema pallidum ay nagpapalipat-lipat sa dugo sa loob ng ilang panahon.

Ang RIBT ay nagiging negatibo sa loob ng anim na buwan pagkatapos ng mabisang paggamot. Maaaring mapanatili ng RIF ang isang positibong reaksyon nang mas matagal. Ito ay dahil sa ang katunayan na ang luminescence ay nangyayari hindi lamang sa mga nabubuhay na bakterya. Ang mga patay na treponema pallidum ay nag-fluoresce din. Gayunpaman, pagkatapos ng paggamot, ang resulta ng RIF ay nagiging mahinang positibo.

Sa nakumpletong therapy, ang resulta ng pagsusulit na ito ay hindi isang diagnostic criterion para sa syphilis.

Maling positibong resulta ng pagsusuri para sa syphilis

Mayroong isang bilang ng mga pathologies kung saan ang isang pagsubok para sa syphilis ay maaaring magbigay ng isang positibong resulta.

Ang mga ganitong sakit ay:

• tuberkulosis;
• sistematikong mga sakit sa autoimmune;
• cirrhosis ng atay;
• malignant neoplasms.

Gayunpaman, sa ganitong mga kaso, ang RIBT ay hindi kailanman umabot sa 100% na positibo.

Ang reaksyon ay nananatili sa isang mahinang positibong antas.

Ang pagsusuri ng RPHA ay katulad ng reaksyon - isang direktang reaksyon ng hemagglutination. Samakatuwid, kung ang RIBT at RPGA ay positibo sa isang matandang babae, ito ay isang dahilan upang kumonsulta sa isang doktor.

Ang ganitong mga resulta ay maaaring magpahiwatig ng mga systemic pathologies, oncology o acute circulatory disorder.

Paano kinokolekta ang dugo para sa RIBT at RIF?

Ang pag-aaral ay nangangailangan ng venous blood.

Ang pagsusulit ay kinukuha sa umaga, mahigpit na walang laman ang tiyan - hindi ka makakain ng pagkain nang hindi bababa sa 4 na oras bago ang pagsusulit.

Sa bisperas ng pagsusulit, dapat mong iwasan ang pagkain ng matatabang pagkain at alkohol.

Ang mga antibacterial na gamot ay dapat na ihinto nang hindi bababa sa 2 linggo bago ang pagsusuri.

Ang pag-inom ng iba pang mga gamot ay dapat munang talakayin sa iyong doktor.

Ang RIBT ay isang labor-intensive at mahal na pagsusuri. Upang maisakatuparan ito, kinakailangan ang mga highly qualified na espesyalista, at ang laboratoryo ay dapat may vivarium.

Maaari kang kumuha ng mga pagsusuri sa dugo para sa RIBT at RIF sa aming klinika.

laki ng font

ORDER ng USSR Ministry of Health na may petsang 02-09-85 1161 ON IMPROVING SEROLOGICAL DIAGNOSIS OF SYPHILIS (kasama ang INSTRUCTIONS FOR... Relevant in 2018

Pamamaraan para sa pagtatakda ng RIF - ABS

Sinuri ang serum ng dugo

Ang dugo upang makakuha ng serum ng dugo ay kinuha mula sa antecubital vein sa isang malinis at tuyo na tubo ng pagsubok sa dami ng 5 ml at pinoproseso sa parehong paraan tulad ng para sa reaksyon ng Wasserman. Ang serum ng dugo ay hindi aktibo nang isang beses sa temperatura na 56° sa loob ng 30 minuto. Dahil sa ang katunayan na ang RIF-abs ay inilagay na hindi sterile, ang paggamit ng mga sterile na lalagyan at pagsunod sa mga sterile na kondisyon kapag nag-iimbak ng serum ng dugo ay hindi kinakailangan. Ito ay mahalaga lamang para sa mas mahabang pangangalaga ng sera ng dugo bago ang pagsubok.

Ang isang suspensyon ng pathogenic pallid Treponema strain Nichols mula sa 7-araw na orchitis ng isang kuneho ay ginagamit bilang isang antigen. Ang mga malulusog na lalaking kuneho na may negatibong resulta ng pagsusuri sa Wasserman at RIT ay nahawaan ng intratesticularly, at kapag nangyari ang orchitis, ang treponemes pallidum ay tinanggal mula sa mga testicle sa parehong paraan tulad ng sa kaso ng pagkuha ng antigen para sa RIT. Ang nagresultang suspensyon ng maputlang treponema ay ibinubuhos mula sa mga piraso ng itlog sa mga sterile test tube na may mga cotton stoppers at iniwan sa refrigerator sa 4°C para sa isang araw, pagkatapos nito ay ihiwalay ito sa sediment at nakaimbak sa ilalim ng parehong mga kondisyon para sa buong panahon. ginagamit.

Ang pagkuha at pag-iimbak ng antigen ay nangangailangan ng pagsunod sa mga sterile na kondisyon, dahil na may parehong antigen, ang isang reaksyon ay maaaring gawin sa loob ng 2-4 na buwan. Para sa antigen, dapat kang pumili ng isang suspensyon kung saan ang agglutination ng mga treponemes ay hindi sinusunod at mayroong sapat na halaga ng mga ito. Ang antigen ay maaaring makuha sa mga ampoules mula sa iba pang mga laboratoryo. Bago ang bawat reaksyon, ang suspensyon ay pinaghalong mabuti at sinusuri sa isang mikroskopyo na may isang dark-field condenser upang matukoy ang density nito. Upang maisagawa ang RIF-abs, kinakailangan na magkaroon ng isang suspensyon na naglalaman ng 40-60 treponemes sa isang madilim na larangan ng pagtingin; kung mayroong isang mas makapal na suspensyon, dapat itong matunaw.

Bilang isang sorbent para sa RIF-abs, ang ultrasonic treponemal antigen para sa RBC, na ginawa ng Kaunas enterprise para sa produksyon ng mga bacterial na paghahanda ng USSR Ministry of Health, ay maaaring gamitin. Ito ay isang suspensyon ng pinaghalong may kulturang Treponema pallidum strains V, VII, VIII, IX at Reiter na winasak ng ultrasound. Ang bawat serye ng sorbent ay dapat na titrated bago gamitin sa RIF-abs para sa mga layuning diagnostic.

Titration ng sorbents

Ang mga sorbents ay titrated sa blood sera ng mga pasyenteng may syphilis, na nagbibigay ng isang matalas na (4+) at mahina (2+) positibong resulta sa RIF sa isang dilution na 1:5, pati na rin sa blood sera ng mga indibidwal na libre mula sa impeksyon sa syphilitic, na nagbibigay ng negatibong resulta sa RIF-5 at hindi tiyak na positibo (2+ o higit pa).

Isang halimbawa ng pagtukoy ng sorbent titer

Ang buong sorbent ay diluted na may phosphate buffer, pH = 7.2, 2, 3, 4 na beses o higit pa. Kumuha ng 3 blood sera mula sa mga pasyenteng may syphilis, isa sa mga ito ay nagbibigay ng matinding positibo (4+) na resulta sa RIF-5, 2 - mahinang positibo (2+), at 5 blood sera mula sa mga taong walang syphilitic infection, 3 sa mga ito magbigay ng hindi tiyak na mga resulta at RIF-5 (2+ o higit pa). Ang lahat ng serum ng dugo ay diluted ng 5 beses na may sorbent, diluted sa turn 2, 3, 4 o higit pang beses na may phosphate buffer. Pagkatapos ang serum ng dugo ay nasubok sa reaksyon. Matapos isaalang-alang ang mga resulta, ang isang pagbabanto ng sorbent ay napili, kung saan ang sorbed blood sera ng mga pasyente na may syphilis ay nagpapanatili ng isang antas ng positivity katulad ng nakuha sa blood sera na diluted na may phosphate buffer, at ang blood sera ng mga taong libre. mula sa syphilitic infection ay hindi gumagawa ng glow. Ang pagbabanto ng sorbent ay ang titer nito.

Pasok ang sorbent titer sa kasong ito isang 1:3 dilution ang nakuha, kung saan ang lahat ng blood sera mula sa mga pasyenteng may syphilis ay nagpapanatili ng antas ng positivity na nakuha sa control, at sa parehong oras, ang nonspecific na positivity ng non-syphilitic blood sera ay mapagkakatiwalaang inalis.

Anti-species luminescent serum

Upang pag-aralan ang human blood sera sa RIF-abs, kinakailangan ang fluorochrome-labeled blood serum ng mga hayop na nabakunahan ng human serum protein. Ang lyophilized luminescent serum ay natutunaw sa ilalim ng mga sterile na kondisyon sa distilled water sa dami na ipinahiwatig sa label ng mga ampoules, ibinuhos sa isang sterile test tube na may rubber stopper at nakaimbak sa 4°C sa loob ng 1-2 buwan habang ginagamit.

Sa araw ng reaksyon, ang kinakailangang halaga ng serum na ito ay natunaw ng titer na may distilled water. Ang gumaganang pagbabanto ng serum na ipinahiwatig sa label ay hindi angkop para sa pag-set up ng isang reaksyon para sa layunin ng serodiagnosis ng syphilis, samakatuwid ang titer ng bawat serye ay dapat na matukoy muli.

Talahanayan Blg. 13

Mga resulta ng sorbent titration

Sinuri ang sera ng dugo	Mga resulta ng RIF-5
	Pagtunaw ng serum ng dugo 1:5 na may buffer (K)	Pagbabawas ng serum ng dugo 1:5 na may sorbent sa pagbabanto
		1: 2	1: 3	1: 4
Serum ng dugo ng isang pasyente na may syphilis
N 1	4+	3+	4+	4+
N 2	2+	1+	2+	2+
N 3	2+		2+	2+
Non-syphilitic blood serum
N 1	3+		1+	2+
N 2	2/3+			2+
N 3	2+			2+
N 4	2+			2+
N 5

Titration ng anti-species luminescent serum

Kumuha ng 5 sera ng dugo mula sa mga pasyente na may syphilis at 5 sera ng dugo mula sa mga malulusog na tao, palabnawin ang mga ito ng 5 beses na may isang sorbent (isinasaalang-alang ang titer nito) at magsagawa ng isang reaksyon gamit sa phase II ang iba't ibang mga dilution ng luminescent serum laban sa human serum globulin ng serye na ang titer ay tinutukoy. Dapat itong isaalang-alang na ang titer ng luminescent serum na kasalukuyang ginawa ng IEM na pinangalanan. Ang N.F. Gamaleya, ay nagbabago kapag nagse-set up ng RIF-abs mula 1: 100 hanggang 1: 140. Kapag isinasaalang-alang ang reaksyon, ang paunang titer ng luminescent serum ay dapat isaalang-alang na ang pagbabanto, kapag ginamit na may positibong blood sera, isang magandang glow ng treponemes ay nakuha, at may negatibong luminescence ng antigen na hindi natanggap. Ang isang mas malaking pagbabanto ng luminescent serum kaysa sa titer ay humahantong sa isang pagbawas sa sensitivity ng reaksyon, at ang isang mas mababang pagbabanto ay humahantong sa isang pagbawas sa pagtitiyak. Pagkatapos matukoy ang paunang titer, dapat itong linawin gamit ang mas malaking bilang ng positibo at negatibong sera ng dugo. Ang huling titer ay maaaring ituring na isa na nasubok sa 100 blood sera, at hindi bababa sa 20 sa mga ito ay dapat na mula sa mga pasyenteng may syphilis.

Upang maiwasan ang pagtubo, pagkatapos ng diluting ang dry luminescent serum na may distilled water, kinakailangang magdagdag ng morthiolate dito sa rate ng 1 volume ng solusyon nito 1: 1000 hanggang 9 volume ng luminescent serum. Kapag kumukuha ng mga bagong ampoules ng parehong serye, ang titer ay dapat lamang suriin at linawin para sa 10 malinaw na positibo at negatibong sera ng dugo.

Isang halimbawa ng pagtukoy sa paunang titer ng luminescent antispecies serum

60 paghahanda ang inihanda, na may bilang mula 1 hanggang 60. 10 serum ng dugo ang kinuha - 5 mula sa mga pasyente na may syphilis, 5 mula sa malusog na tao. Ang lahat ng serum ng dugo ay natunaw ng 5 beses na may titrated sorbent.

Sa mga gamot na may bilang na 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, ang parehong 10 serum ng dugo, na natunaw ng 5 beses na may sorbent, ay inilapat sa phase I ng reaksyon. Sa phase II ng reaksyon, ang luminescent serum na diluted 1:100 ay inilapat sa 1-10 na gamot, 1:110 hanggang 11-20, 1:120 hanggang 21-30, 1:130 hanggang 31-40, 1 hanggang 41-50 : 140, sa 51-60 - 1: 150.

Pamamaraan para sa pagtatakda ng RIF-abs

Ang mga paghahanda ay inihanda mula sa antigen sa manipis, well-defatted glass slide, sa likod kung saan ang mga bilog na may diameter na 0.7 cm ay minarkahan ng isang pamutol ng salamin (10 bilog sa 1 glass slide). Sa loob ng bilog, ang isang antigen suspension ng Treponema pallidum ay inilapat sa salamin. Gamit ang selyadong dulo ng isang Pasteur pipette, ipamahagi ang suspensyon sa loob ng bilog sa isang circular motion, patuyuin ito sa hangin at ayusin ito ng 10 minuto sa chemically pure acetone. Pagkatapos ay binibilang ang mga gamot. Ang inactivated test blood sera ay diluted 5 beses na may sorbent na diluted ng titer na may buffer solution. Ang ilang mga test tube ay inilalagay sa isang rack, ang bilang at bilang nito ay tumutugma sa bilang at bilang ng blood sera na sinusuri. Pipette 0.2 ml diluted sorbent sa test tubes, pagkatapos ay magdagdag ng 0.05 ml ng buong test blood serum at ihalo na rin. Ang serum ng dugo ay maaaring matunaw gamit ang Florinsky apparatus. Ang serum ng dugo na diluted na may sorbent ay inilalapat sa antigen upang pantay na masakop ang smear, at ang mga paghahanda ay inilalagay sa isang basang silid, na sarado na may takip at inilagay sa isang thermostat sa 37° sa loob ng 30 minuto (phase I ng ang reaksyon). Matapos ang unang yugto, ang mga paghahanda ay maingat na hinugasan sa 2 bahagi ng phosphate buffer, at ang mga paghahanda ay inilalagay sa pangalawang bahagi sa loob ng 10 minuto, tuyo, pagkatapos nito ay muling inilagay sa isang mahalumigmig na silid, isang luminescent serum na natunaw ng titer ay inilapat at iniwan sa temperatura ng silid sa loob ng 30 minuto (mga reaksyon sa phase II). Sa pagtatapos ng ikalawang yugto, ang mga paghahanda ay hugasan ng pospeyt buffer tulad ng inilarawan sa itaas, tuyo at isang patak ng non-luminescent immersion oil (dimethyl phthalate) ay inilapat sa ibabaw ng mga smears.

Ang pagsusuri ng mga paghahanda ay isinasagawa sa isang fluorescent microscope na may DRSh-250 mercury-quartz lamp na may isang immersion system, isang 4X o 5X eyepiece, SZS-7 o 14, FS-1 na mga filter. BS-8 at ZhS-18 o T-2N. Ang reaksyon ay isinasaalang-alang sa pamamagitan ng pagtatasa ng glow ng Treponema pallidum. Ang blood sera na nagbibigay ng glow na 4+, 3+ at 2+ ay itinuturing na positibo sa RIF-abs. Ang isang makinang na berde-dilaw na glow ay na-rate na 4+, maliwanag - 3+, mahinang glow - 2+. Ang sera ng dugo na nagbibigay ng glow ng 1+ (treponema sa paghahanda ay mas matindi ang kulay kaysa sa background) o hindi nagbibigay nito ay itinuturing na negatibo.

Sa bawat pag-setup ng RIF-abs, dapat gamitin ang mga sumusunod na kontrol:

Malakas na positibong kontrol. Serum ng dugo ng isang pasyente na may syphilis, na nagbibigay ng luminescence na 4+ kapag natunaw ng 5 beses na may buffer. Kapag natunaw ng 5 beses sa isang sorbent, ang serum ng dugo ay hindi dapat mawala ang antas ng pagiging positibo nito nang higit sa 1+.

Mahina ang positibong kontrol. Buo o diluted na serum ng dugo ng isang pasyente na may syphilis, na nagbibigay ng mahinang antas ng antigen luminescence na 2+ kapag natunaw ng 5 beses na may buffer. Kapag natunaw ng isang sorbent, ang positivity nito ay dapat manatili.

Hindi tiyak na kontrol. Non-syphilitic blood serum, na nagbibigay ng fluorescence ng hindi bababa sa 2+ kapag diluted na may buffer. Kapag natunaw ng isang sorbent, ang positivity nito ay dapat na alisin.

Ang mga kontrol ng antigen, sorbent, luminescent serum ay maaari lamang i-install kapag gumagamit ng bagong serye ng mga sangkap na ito.

Pamamaraan para sa pagsasagawa ng RIF-abs na may capillary blood

Ang RIF-abs ay maaaring isagawa hindi lamang sa serum ng dugo, kundi pati na rin sa dugo na kinuha mula sa isang daliri. Ang pagbabagong ito ng RIF-abs ay maaaring gamitin kapag sinusuri ang mga bata para sa syphilis, kapag mahirap kumuha ng dugo mula sa ugat sa mga matatanda, at sa panahon ng mass examination ng iba't ibang populasyon para sa syphilis.

Kapag nag-staging ng RIF-abs na may dugo, ang parehong mga sangkap ng reaksyon ay ginagamit tulad ng kapag nagtatanghal ng RIF-abs na may serum ng dugo (antigen, sorbent, luminescent serum). Ang titer ng luminescent serum ay tinutukoy ayon sa pamamaraan sa itaas, ngunit kapag nagtatanghal ng isang reaksyon sa dugo. Pagkatapos mabutas ang daliri ng pasyente, ang dugo para sa pagsusuri ay iginuhit gamit ang isang micropipette sa markang 0.1 ml, mabilis na hinipan sa isang test tube na naglalaman ng 0.3 ML ng distilled water, halo-halong lubusan sa isang pipette at sinala sa pamamagitan ng isang filter ng papel na binasa ng distilled water. Ang isang reaksyon na may diluted na dugo ay maaaring gawin sa araw ng pagkolekta o pagkatapos ng 1-2 araw, kung ito ay nakaimbak sa 4°C.

Kaagad bago ang reaksyon, 0.1 ml ng buong sorbent ay idinagdag sa lahat ng mga sample ng dugo na kasama sa reaksyon, hinaluan ng pipette at pag-alog, at inilagay sa isang thermostat sa 37° sa loob ng 30 minuto. Pagkatapos ang dugo na ginagamot sa sorbent ay inilapat sa mga antigen smears at inilagay sa isang mamasa-masa na silid sa 37° (phase 1 ng reaksyon). Matapos mag-expire ang panahon ng pagkakalantad, ang mga paghahanda ay hinuhugasan sa unang bahagi ng phosphate buffer upang walang mga bakas ng dugo na mananatili sa mga slide at ilagay sa pangalawang bahagi ng buffer sa loob ng 10 minuto. Pagkatapos matuyo ang mga smears, ang phase II ng reaksyon ay isinasagawa. Sa kasong ito, ang luminescent serum laban sa mga globulin ng tao, na natunaw ayon sa titer na itinatag para sa pagbabagong ito ng RIF, ay inilalapat sa mga paghahanda. Ang mga baso sa basang silid ay muling inilagay sa isang termostat sa 37°.

Pagkatapos ng 30 minuto, ang mga slide ay hugasan muli sa 2 bahagi ng phosphate buffer sa loob ng 10 minuto, tuyo at ini-mount para sa fluorescence microscopy. Ang pag-aaral ng mga gamot at pagtatala ng mga resulta ng reaksyon ay isinasagawa sa parehong paraan tulad ng kapag nagsasagawa ng RIF-abs na may serum ng dugo.

Pamamaraan para sa pag-set up ng RIF-200

Ang paraan ng pag-set up ng RIF-abs at RIF-200 ay magkatulad. Kapag nagtatakda ng RIF-200, ang pagproseso ng test blood sera, paghahanda ng antigen, paghahanda ng anti-species luminescent serum at ang titration nito ay isinasagawa sa parehong paraan tulad ng kapag nagtatakda ng RIF-abs. Dapat lamang itong isaalang-alang na ang mga titer ng luminescent serum na kasalukuyang ginawa sa RIF-200 ay mula 1:20 hanggang 1:50.

Pamamaraan para sa pag-set up ng RIF-200

Ang test blood sera ay diluted 200 beses na may phosphate buffer. Upang gawin ito, 3 hilera ng mga test tube ang inilalagay sa isang stand, ang bilang at pagnunumero nito sa bawat hilera ay tumutugma sa bilang at pagnunumero ng nasubok na sera ng dugo sa workbook. Sa unang hilera, ang buong test blood sera ay ibinuhos, sa pangalawang hilera, 0.45 ml ng buffer ay ibinuhos sa mga test tube, sa pangatlo - 0.95 ml ng buffer. Sa pangalawang hilera, ang isang 10-tiklop na pagbabanto ng serum ng dugo ay inihanda, kung saan ang 0.05 ML ng test serum ng dugo ay kinuha mula sa bawat test tube ng unang hilera na may hiwalay na 1 ml na nagtapos na pipette, na inilipat sa kaukulang test tube ng ang pangalawang hilera at pinaghalo sa buffer na magagamit doon. Mula sa bawat test tube ng pangalawang hilera, gamit ang parehong pipette, ilipat ang 0.05 ML ng test blood serum na diluted 10 beses sa kaukulang test tube ng ikatlong hilera at kumuha ng 200-fold dilution.

Kapag nagse-set up ng isang reaksyon, ang test blood sera na natunaw ng 200 beses ay inilalapat sa mga gamot na inilagay sa isang basang silid upang ang kanilang mga numero na nakasaad sa mga test tube ay tumutugma sa mga numero sa mga slide. Matapos ilapat ang serum ng dugo sa mga paghahanda, ang basa-basa na silid ay inilalagay sa loob ng 30 minuto sa isang termostat na may temperatura na 37° (I phase ng reaksyon). Pagkatapos ang mga paghahanda ay hugasan ng 10 minuto sa 2 bahagi ng buffer at tuyo. Pagkatapos nito, muli silang inilagay sa isang mamasa-masa na silid at ang isang luminescent na serum na diluted ng titer ay inilapat sa lahat ng mga ito (phase II ng reaksyon). Ang pangalawang yugto ay isinasagawa sa loob ng 30 minuto sa temperatura ng silid, pagkatapos kung saan ang mga paghahanda ay hugasan ng 10 minuto, tuyo at naka-mount para sa fluorescence microscopy.

Ang mga resulta ng RIF-200 ay isinasaalang-alang sa parehong paraan tulad ng RIF-abs.

Sa kaso kung ang mga clinician ay interesado sa titer ng fluorescent antibodies sa serum ng dugo ng pasyente, ang RIF-abs at RIF-200 ay dapat bigyan ng mga serial dilution ng test blood sera at ang titer ng fluorescent antibodies ay dapat ituring na pinakamataas na dilution ng ang blood serum na nagbibigay pa rin ng positibong resulta ng reaksyon. Nakaugalian na tukuyin ang isang titer sa pamamagitan ng isang numero na nagpapakilala sa antas ng pagbabanto ng test blood serum, halimbawa, 5, 10, 20, 40, atbp. (RIF-abs) o 200, 400, 800, atbp. (RIF-200).

Kapag nagse-set up ng parehong pagbabago ng reaksyon, ang isang phosphate buffer ng sumusunod na komposisyon ay dapat gamitin upang palabnawin ang test blood sera at upang hugasan ang mga paghahanda pagkatapos ng phase I at II: 1 litro ng distilled water, 6.8 g ng sodium chloride, 1.48 g ng disubstituted sodium phosphate, 0. 43 g ng monosubstituted potassium phosphate (PH = 7.2). Ang handa na solusyon ay nakaimbak sa temperatura ng silid nang hindi hihigit sa isang linggo.

Dahil sa posibilidad na makakuha ng mga negatibong resulta sa pagkakaroon ng fluorescent antibodies, ang dugo at serum ay hindi dapat masuri sa RIF-abs at RIF-200 sa panahon ng paggamot ng mga pasyente na may penicillin.

Pamamaraan para sa pagtatakda ng RIF-ts

Ang maagang pagsusuri ng mga sugat sa nervous system sa syphilis ay paksang isyu sa paglaban sa sakit na ito. Dahil sa ang katunayan na ang RIF-c ay mas sensitibo kaysa sa lahat ng iba pang mga pagsubok na ginagamit para sa cerebrospinal fluid diagnosis ng syphilis, ang pagbabagong ito ng RIF ay maaaring irekomenda para sa pag-diagnose ng syphilitic lesyon ng central nervous system sa lahat ng anyo ng syphilis.

Upang subukan ang RIF-c, ang parehong antigen, luminescent serum, ay ginagamit bilang para sa pagsubok ng RIF-abs at RIF-200 na may serum ng dugo. Ang pagpapasiya ng fluorescent antibodies sa cerebrospinal fluid at serum ng dugo at ang pagtatala ng reaksyon ay magkatulad din.

Ang cerebrospinal fluid ay ipinapasok sa reaksyon na hindi aktibo at buo. Bago isagawa ang reaksyon, maaari itong maiimbak sa freezer compartment ng refrigerator sa mga test tube sa ilalim ng rubber stoppers hanggang 2 linggo. Ang lasaw ay isinasagawa sa temperatura ng silid.

Pamamaraan para sa pagtatakda ng RIF-ts

Sa phase I ng reaksyon sa antigen, 0.05 ml ng undiluted test cerebrospinal fluid ay inilapat, ang mga paghahanda ay inilalagay sa isang mahalumigmig na silid sa loob ng 30 minuto sa temperatura ng silid. Pagkatapos ay hugasan sila ng phosphate buffer, pH = 7.2, sa loob ng 10 minuto at tuyo. Sa phase II, ang isang diluted luminescent serum ay inilalapat sa mga gamot, na na-titrated kapag ang isang reaksyon sa cerebrospinal fluid ay naitatag. Ang mga paghahanda ay pinananatili sa temperatura ng silid sa loob ng 30 minuto sa isang basang silid, hinugasan, pinatuyo, at inilagay para sa fluorescence microscopy.

Pinagmumulan ng mga pagkakamali

1. Pagkabigong sumunod sa mga kondisyon para sa paghahanda, pag-iimbak ng mga reagents at pag-setup ng reaksyon.

2. Mababang kalidad ng luminescent serum at hindi tumpak na pagpapasiya ng titer nito.

3. Paglalapat ng test material o luminescent serum kapag nagtatakda ng reaksyon hindi sa gamot, ngunit sa kabilang panig ng glass slide.

4. Maling setting ng ilaw sa fluorescence microscope.

5. Mababang kalidad ng antigen.