Bahagi 1

MGA PARAAN NG PANANALIKSIK SA HISTOLOGY, CYTOLOGY AT EMBRYOLOGY

Para sa pag-unlad ng histology, cytology at embryology, ang pagpapakilala ng mga nakamit ng pisika at kimika, mga bagong pamamaraan ng mga kaugnay na agham - biochemistry, molecular biology, genetic engineering ay napakahalaga.

Ang mga modernong pamamaraan ng pananaliksik ay hindi lamang ginagawang posible na pag-aralan ang mga tisyu sa kabuuan, kundi pati na rin upang ihiwalay ang mga indibidwal na uri ng cell mula sa kanila upang pag-aralan ang kanilang mahahalagang aktibidad sa loob ng mahabang panahon, upang ihiwalay ang mga indibidwal na organel ng cell at ang kanilang mga macromolecule (halimbawa, mga molekula ng deoxy ribonucleic acid- DNA), upang siyasatin ang kanilang functional features.

Nagbukas ang mga ganitong pagkakataon kaugnay ng paglikha ng mga bagong instrumento at teknolohiya - iba't ibang uri ng mikroskopyo, teknolohiya ng kompyuter, pagsusuri ng X-ray diffraction, paggamit ng nuclear magnetic resonance (NMR), radioactive isotopes at autoradiography, electrophoresis at chromatography, fractionation ng mga nilalaman ng cell gamit ang ultracentrifugation, paghihiwalay at paglilinang ng mga cell, pagkuha ng mga hybrids; ang paggamit ng mga biotechnological na pamamaraan - pagkuha ng mga hybridoma at monoclonal antibodies, recombinant DNA, atbp.

Kaya, ang mga biological na bagay ay maaaring pag-aralan sa mga antas ng tissue, cellular, subcellular at molekular. Sa kabila ng pagpapakilala sa mga natural na agham ng iba't ibang biochemical, biophysical, pisikal at teknolohikal na pamamaraan na kinakailangan upang malutas ang maraming mga isyu na may kaugnayan sa mahahalagang aktibidad ng mga selula at tisyu, Ang histology ay nananatiling panimula na isang morphological science na may sariling hanay ng mga pamamaraan. Ginagawang posible ng huli na makilala ang mga proseso na nagaganap sa mga selula at tisyu, ang kanilang mga tampok na istruktura.

Ang mga pangunahing yugto ng cytological at histological analysis ay ang pagpili ng object ng pag-aaral, paghahanda nito para sa pagsusuri sa ilalim ng mikroskopyo, qualitative at quantitative analysis ng mga imahe ng histological elements.

Ang mga bagay ng pag-aaral ay mga buhay at naayos na mga cell at tisyu, ang kanilang mga imahe ay nakuha gamit ang ilaw at elektrikal

mga electron microscope o sa display screen. Mayroong ilang mga pamamaraan na nagpapahintulot sa pagsusuri ng mga bagay na ito.

2.1. MGA PARAAN PARA SA MICROSCOPY NG HISTOLOGICAL SPECIMENS

Ang pangunahing paraan para sa pag-aaral ng biological microobjects ay light at electron microscopy, na malawakang ginagamit sa eksperimental at klinikal na kasanayan.

Ang mikroskopya ay ang pangunahing paraan ng pag-aaral ng mga micro-object na ginamit sa biology nang higit sa 300 taon. Ang iba't ibang uri ng light microscope at electron microscope ay ginagamit upang pag-aralan ang mga histological na paghahanda. Mula sa paglikha at paggamit ng mga unang mikroskopyo, sila ay patuloy na napabuti. Ang mga modernong mikroskopyo ay kumplikadong optical system na may mataas na resolution. Ang laki ng pinakamaliit na istraktura na makikita sa isang mikroskopyo ay tinutukoy ng pinakamaliit na nareresolba na distansya (d), na higit sa lahat ay nakadepende sa wavelength ng liwanag (λ) at sa wavelength ng electromagnetic oscillations ng electron flow, atbp. Ang pag-asa na ito ay tinatayang tinutukoy ng formula d= λ/2. Kaya kaysa mas kaunting haba waves, mas maliit ang resolvable distance, at mas maliit ang microstructures na makikita sa paghahanda.

Banayad na mikroskopya. Upang pag-aralan ang mga histological micro-object, ang mga ordinaryong light microscope at ang kanilang mga varieties ay ginagamit, kung saan ginagamit ang mga light source na may mga wave ng iba't ibang wavelength. Sa conventional light microscopes, ang pinagmumulan ng pag-iilaw ay natural o artipisyal na liwanag (Larawan 2.1). Ang pinakamababang wavelength ng nakikitang bahagi ng spectrum ay humigit-kumulang 0.4 µm. Samakatuwid, para sa isang maginoo na light microscope, ang pinakamaliit na nareresolba na distansya ay humigit-kumulang 0.2 µm, at ang kabuuang pag-magnify (layunin ng pag-magnify ng mga beses ng eyepiece magnification) ay maaaring 1500-2500.

Kaya, gamit ang isang magaan na mikroskopyo, makikita ng isang tao hindi lamang ang mga indibidwal na mga cell na may sukat mula 4 hanggang 150 microns, kundi pati na rin ang kanilang mga intracellular na istruktura - mga organelles, mga pagsasama. Upang mapahusay ang kaibahan ng mga micro-object, ginagamit ang kanilang paglamlam.

ultraviolet mikroskopya. Ito ay isang uri ng light microscopy. Ang ultraviolet mikroskopyo ay gumagamit ng mas maikli ultra-violet ray na may wavelength na humigit-kumulang 0.2 µm. Ang nareresolba na distansya dito ay 2 beses na mas mababa kaysa sa maginoo na light microscope, at humigit-kumulang 0.1 μm. Ang imahe na nakuha sa ultraviolet rays, na hindi nakikita ng mata, ay na-convert sa isang nakikita sa pamamagitan ng pagpaparehistro sa isang photographic plate o sa pamamagitan ng paglalapat mga espesyal na aparato(luminescent screen, image intensifier tube).

Fluorescent (luminescent) mikroskopya. Ang phenomena ng fluorescence ay nakasalalay sa katotohanan na ang mga atomo at molekula ng isang bilang ng mga sangkap, sumisipsip ng maikli.

kanin. 2.1. Mga mikroskopyo para sa biological na pananaliksik:

a- light biological microscope "Biolam-S": 1 - base; 2 - may hawak ng tubo; 3 - hilig na tubo; 4 - eyepiece; 5 - rebolber; 6 - mga lente; 7 - talahanayan; 8 - condenser na may iris diaphragm; 9 - tornilyo ng pampalapot; 10 - salamin; 11 - micrometer tornilyo; 12 - macrometric screw; b- electron microscope EMV-100AK na may automated image processing system: 1 - microscope column (may electron-optical system at sample chamber); 2 - control panel; 3 - camera na may luminescent screen; 4 - bloke ng pagsusuri ng imahe; 5 - sensor ng signal ng video; sa- confocal microscope: 1 - light microscope; 2 - recorder ng imahe (photoelectronic multiplier);

3 - scanning device para sa paglipat ng light beam kasama ang axis X, Y, Z;

4 - power supply at laser control rack; 5 - computer para sa pagproseso ng imahe

wave rays, pumunta sa isang nasasabik na estado. Ang reverse transition mula sa excited na estado patungo sa normal na estado ay nangyayari sa paglabas ng liwanag, ngunit may mas mahabang wavelength. Sa isang fluorescent microscope, ang mga superhigh-pressure na mercury o xenon lamp ay ginagamit bilang mga ilaw na mapagkukunan para sa paggulo ng fluorescence, na may mataas na liwanag sa spectral na rehiyon na 0.25-0.4 μm (malapit sa ultraviolet rays) at 0.4-0.5 μm (asul na ilaw). mga lilang sinag). Ang wavelength ng fluorescence light wave ay palaging mas malaki kaysa sa wavelength ng exciting na liwanag, kaya pinaghihiwalay sila gamit ang light filters at ang imahe ng object ay pinag-aaralan lamang sa fluorescence light. Matukoy ang pagkakaiba sa pagitan ng sarili, o pangunahin, at sapilitan, o pangalawa, pag-ilaw. Anumang cell ng isang buhay na organismo ay may sariling fluorescence, ngunit ito ay madalas na napakahina.

Ang serotonin, catecholamines (adrenaline, norepinephrine) na nasa nerve, mast at iba pang mga cell ay may pangunahing fluorescence pagkatapos ng tissue fixation sa formaldehyde vapor sa 60-80 °C (Falk method).

Ang pangalawang pag-ilaw ay nangyayari kapag ang mga paghahanda ay ginagamot ng mga espesyal na tina - fluorochromes.

Mayroong iba't ibang mga fluorochrome na partikular na nagbubuklod sa ilang mga macromolecules (acridine orange, rhodamine, fluorescein, atbp.). Halimbawa, kapag ang mga gamot ay ginagamot ng acridine orange, ang DNA at ang mga compound nito sa mga cell ay may maliwanag na berdeng glow, habang ang RNA at ang mga derivative nito ay may maliwanag na pulang glow. Mayroong maraming mga tina na maaaring magamit upang makilala ang mga protina, lipid, intracellular calcium, magnesium, sodium ions, atbp. Kaya, ang spectral na komposisyon ng radiation ay nagdadala ng impormasyon tungkol sa panloob na istraktura ng bagay at ang kemikal na komposisyon nito. Ang isang variant ng fluorescence microscopy method, kung saan ang excitation at fluorescence emission ay nangyayari sa ultraviolet region ng spectrum, ay tinatawag na ultraviolet fluorescence microscopy method.

Upang mapataas ang kaibahan ng mga bagay na fluorochrome, confocal variant optical mikroskopyo (tingnan ang Fig. 2.1, c). Bilang pag-iilaw, ginagamit ang isang sinag ng monochromatic na ilaw ng maliit na diameter, na lumilikha ng pinagmumulan ng laser. Sa bawat sandali ng oras, isang maliit na lugar (volume) ng cell ang nasa pokus ng mikroskopyo. Ang sinag ng liwanag ay gumagalaw sa ibabaw ng bagay (ini-scan ang bagay kasama ang mga palakol X, Y, Z). Sa bawat oras na gumagalaw ang light beam sa isa sa mga linya ng pag-scan, nakukuha ang impormasyon tungkol sa istrukturang pinag-aaralan na matatagpuan sa isang partikular na punto (volume) kasama ang linya ng pag-scan (optical section ng cell), halimbawa, tungkol sa lokalisasyon ng mga protina sa microtubule sa cell. Ang lahat ng impormasyong natanggap mula sa bawat cell scanning point ay ipinadala sa isang computer, pinagsama gamit ang isang espesyal na programa, at ipinapakita sa monitor screen sa anyo ng isang contrast na imahe. Gamit ang pamamaraang ito ng microscopy, ang impormasyon ay nakuha tungkol sa hugis ng mga cell, ang cytoskeleton, ang istraktura ng nucleus, chromosome, atbp. Gamit ang isang computer program, batay sa impormasyong natanggap para sa bawat linya ng pag-scan, lumilikha ito ng isang three-dimensional na imahe ng cell, na nagpapahintulot sa iyo na isaalang-alang ang cell sa ilalim iba't ibang anggulo pangitain.

Phase contrast microscopy. Ang pamamaraang ito ay ginagamit upang makakuha ng mga high-contrast na larawan ng mga transparent at walang kulay na buhay na bagay na hindi nakikita sa mga karaniwang pamamaraan ng microscopy. Ang pamamaraan ay batay sa katotohanan na ang liwanag, na dumadaan sa mga istruktura na may iba't ibang mga indeks ng repraktibo, ay nagbabago ng bilis nito. Ang disenyo ng mikroskopyo optics na ginamit ay ginagawang posible na i-convert ang mga pagbabago sa yugto ng liwanag na dumadaan sa hindi nabahiran na paghahanda, na hindi nakikita ng mata, sa mga pagbabago sa amplitude nito, ibig sabihin, ang ningning ng nagresultang imahe. Ang phase contrast method ay nagbibigay ng contrast ng mga pinag-aralan na hindi nabahiran na mga istruktura dahil sa isang espesyal na annular diaphragm na inilagay sa condenser at ang tinatawag na phase plate na matatagpuan sa layunin. Ang isang variation ng phase contrast method ay ang phase-dark-field contrast method, na nagbibigay ng negatibong larawan kumpara sa isang positive phase contrast.

Dark field microscopy. Sa isang dark-field microscope, tanging ang liwanag na nagbibigay ng diffraction (wave bending) ng mga istruktura sa paghahanda ang nakakaabot sa layunin. Nangyayari ito dahil sa pagkakaroon ng isang espesyal na pampalapot sa mikroskopyo, na nag-iilaw sa paghahanda na may mahigpit na pahilig na liwanag; ang mga sinag mula sa illuminator ay nakadirekta mula sa gilid. Kaya, ang patlang ay mukhang madilim, at ang maliliit na particle sa paghahanda ay sumasalamin sa liwanag, na pagkatapos ay pumapasok sa lens. Sa klinika, ang pamamaraang ito ay ginagamit upang pag-aralan ang mga kristal sa ihi ( uric acid, oxalates), upang ipakita ang mga spirochetes, sa partikular Treponema pallidum, nagiging sanhi ng syphilis, atbp.

interference microscopy. Ang isang pagkakaiba-iba ng phase contrast microscope ay ang interference microscope, na idinisenyo upang mabilang ang masa ng tissue. Ginagamit ang differential interference microscope (na may Nomarsky optics) upang pag-aralan ang lunas ng ibabaw ng mga cell at iba pang biological na bagay.

Sa isang interference microscope, ang sinag ng liwanag mula sa illuminator ay nahahati sa dalawang stream: ang isa ay dumadaan sa bagay at nagbabago sa yugto ng oscillation, ang pangalawa ay lumalampas sa bagay. Sa prisms ng layunin, ang parehong mga beam ay nakapatong sa bawat isa. Bilang resulta, ang isang imahe ay binuo kung saan ang mga seksyon ng isang micro-object na may iba't ibang kapal at density ay naiiba sa kaibahan. Pagkatapos mabibilang ang mga pagbabago, tukuyin ang konsentrasyon at masa ng tuyong bagay.

Hinahayaan ka ng phase-contrast at interference microscope na mag-aral mga buhay na selula. Ginagamit nila ang interference na nangyayari kapag pinagsama ang dalawang hanay ng mga alon upang lumikha ng imahe ng mga microstructure. Ang bentahe ng phase-contrast, interference at dark-field microscopy ay ang kakayahang obserbahan ang mga cell sa proseso ng paggalaw at mitosis. Sa kasong ito, maaaring i-record ang paggalaw ng cell gamit ang time-lapse (frame-by-frame) microvideo filming.

polarizing microscopy. Ang polarizing microscope ay isang pagbabago ng isang light microscope kung saan naka-install ang dalawang polarizing filter: ang una (polarizer) - sa pagitan ng light beam at ng bagay, at ang pangalawa (analyzer) - sa pagitan ng object lens at ng mata. Ang ilaw ay dumadaan sa unang filter sa isang direksyon lamang, ang pangalawang filter ay may pangunahing axis,

na matatagpuan patayo sa unang filter, at hindi ito nagpapadala ng liwanag. Lumilikha ito ng dark field effect. Ang mga istrukturang naglalaman ng mga longitudinally oriented na molekula (collagen, microtubule, microfilaments) at mga kristal na istruktura ay may kakayahang paikutin ang axis ng mga light ray na nagmumula sa polarizer. Kapag binago ang axis ng pag-ikot, lumilitaw ang mga istrukturang ito bilang kumikinang sa madilim na background. Ang kakayahan ng mga kristal o paracrystalline formations na hatiin ang isang light wave sa isang ordinaryong wave at isang wave na patayo dito ay tinatawag na birefringence. Ang kakayahang ito ay tinataglay ng mga fibril ng striated na kalamnan.

Electron microscopy. Ang isang malaking hakbang pasulong sa pagbuo ng teknolohiya ng mikroskopya ay ang paglikha at paggamit ng electron microscope (tingnan ang Fig. 2.1). AT electron microscope gumagamit ng stream ng mga electron na may mga alon na mas maikli kaysa sa isang light microscope. Sa boltahe na 50,000 V, ang wavelength ng electromagnetic oscillations na nagmumula sa paggalaw ng isang stream ng mga electron sa isang vacuum ay 0.0056 nm. Ito ay theoretically kalkulado na ang resolvable distansya sa ilalim ng mga kundisyong ito ay maaaring tungkol sa 0.002 nm, o 0.000002 μm, ibig sabihin, 100,000 beses na mas mababa kaysa sa isang light mikroskopyo. Sa pagsasagawa, sa modernong mga mikroskopyo ng elektron, ang nalulusaw na distansya ay tungkol sa 0.1-0.7 nm.

Sa histology, ginagamit ang transmission (transmission) electron microscopes (TEM), scanning (scanning) electron microscopes (SEM) at ang kanilang mga pagbabago. Sa tulong ng TEM, isang planar na imahe lamang ng microobject na pinag-aaralan ang maaaring makuha. Upang makakuha ng spatial na representasyon ng mga istruktura, ginagamit ang mga SEM na maaaring lumikha ng isang three-dimensional na imahe. Gumagana ang isang scanning electron microscope sa prinsipyo ng pag-scan ng isang bagay na pinag-aaralan gamit ang isang electron microprobe, ibig sabihin, ito ay sunud-sunod na "nararamdaman" ang mga indibidwal na punto ng ibabaw na may matinding nakatutok na electron beam. Ang pag-aaral na ito ng isang bagay ay tinatawag pag-scan(pagbabasa), at ang pattern kung saan gumagalaw ang microprobe - raster. Ang resultang imahe ay ipinapakita sa isang screen ng telebisyon, ang electron beam na kung saan ay gumagalaw kasabay sa microprobe.

Ang mga pangunahing bentahe ng pag-scan ng electron microscopy ay isang malaking depth of field, isang malawak na hanay ng mga patuloy na pagbabago sa magnification (mula sampu hanggang sampu-sampung libong beses) at mataas na resolution. Ang mga modernong bersyon ng mga instrumento para sa pag-aaral sa ibabaw ng isang bagay ay ang atomic force microscope at ang scanning tunneling microscope.

Electron microscopy gamit ang paraan ng pagyeyelo- chipping ginagamit upang pag-aralan ang mga detalye ng istraktura ng mga lamad at intercellular na koneksyon. Ang mga cell ay nagyelo sa mababang temperatura (-160°C) upang makagawa ng mga chips. Kapag sinusuri ang lamad, ang cleavage plane ay dumadaan sa gitna ng lipid bilayer. Dagdag pa, ang mga metal (platinum, palladium, uranium) ay idineposito sa mga panloob na ibabaw ng nakuha na halves ng mga lamad, pinag-aaralan sila gamit ang TEM at microphotography.

Paraan ng cryoelectron microscopy. Ang mabilis na nagyelo na manipis na layer (mga 100 nm) ng sample ng tissue ay inilalagay sa isang mikroskopikong grid at sinusuri sa ilalim ng vacuum ng mikroskopyo sa -160°C.

Paraan ng mikroskopyo ng elektron "nagyeyelo - pag-ukit" ginagamit upang pag-aralan ang panlabas na ibabaw ng mga lamad ng cell. Pagkatapos ng mabilis na pagyeyelo ng mga selula sa napakababang temperatura, ang bloke ay nahahati gamit ang talim ng kutsilyo. Ang mga nagresultang kristal ng yelo ay tinanggal sa pamamagitan ng sublimation ng tubig sa isang vacuum. Pagkatapos ang mga lugar ng mga cell ay nililiman sa pamamagitan ng sputtering ng isang manipis na pelikula ng isang mabigat na metal (halimbawa, platinum). Ginagawang posible ng pamamaraan na ipakita ang tatlong-dimensional na organisasyon ng mga istruktura.

Kaya, ang mga pamamaraan ng pagyeyelo-cleavage at pagyeyelo-pag-ukit ay ginagawang posible na pag-aralan ang mga hindi nakapirming mga selula nang walang pagbuo ng mga artifact na dulot ng pag-aayos sa kanila.

Ang mga pamamaraan ng kaibahan sa mga asing-gamot ng mabibigat na metal ay ginagawang posible na pag-aralan ang mga indibidwal na macromolecules - DNA, malalaking protina (halimbawa, myosin) sa isang electron microscope. Sa negatibong contrasting, pinag-aaralan ang mga pinagsama-samang macromolecules (ribosomes, virus) o protina filament (actin filament).

Electron microscopy ng ultrathin section na nakuha ng cryoultramicrotomy. Sa pamamaraang ito, ang mga piraso ng tissue na walang pag-aayos at pagbuhos sa solidong media ay mabilis na pinalamig sa likidong nitrogen sa temperatura na -196 °C. Nagbibigay ito ng pagsugpo sa mga metabolic na proseso ng mga selula at ang paglipat ng tubig mula sa likidong bahagi patungo sa solid. Susunod, ang mga bloke ay pinutol sa isang ultramicrotome sa mababang temperatura. Ang pamamaraang ito ng sectioning ay karaniwang ginagamit upang matukoy ang aktibidad ng mga enzyme, pati na rin para sa pagsasagawa ng mga immunochemical reaction. Upang makita ang mga antigen, ang mga antibodies na nauugnay sa mga particle ng koloidal na ginto ay ginagamit, ang lokalisasyon na kung saan ay madaling makilala sa mga paghahanda.

Mga paraan ng ultrahigh-voltage microscopy. Ginagamit ang mga electron microscope na may pabilis na boltahe na hanggang 3,000,000 V. Ang bentahe ng mga mikroskopyo na ito ay pinapayagan nila ang isa na suriin ang mga bagay na may malaking kapal (1-10 μm), dahil sa mataas na enerhiya ng elektron sila ay hindi gaanong nasisipsip ng bagay. Ang stereoscopic imaging ay nagbibigay-daan sa pagkuha ng impormasyon tungkol sa three-dimensional na organisasyon ng mga intracellular na istruktura na may mataas na resolusyon (mga 0.5 nm).
MGA PARAAN PARA SA IMBESTIGASYON NG MGA FIXED CELLS AT TISSUES

Ang pangunahing bagay ng pag-aaral ay ang mga paghahanda sa histological na inihanda mula sa mga nakapirming tisyu at organo. Ang gamot ay maaaring pahid(halimbawa, pahid ng dugo, bone marrow, laway, cerebrospinal fluid, atbp.), imprint(hal. pali, thymus, atay), pelikula tissue (hal., peritoneum, pleura, malambot na shell utak), manipis na hiwa. Maaaring pag-aralan ang mga paghahanda sa histological nang walang espesyal na pagproseso, halimbawa, gamit ang isang phase-contrast microscope. Kadalasan para sa light microscopy, tissue o organ section ay ginagamit, na sinusundan ng kanilang pangkulay.

Ang proseso ng paggawa ng histological na paghahanda para sa light at electron microscopy ay kinabibilangan ng mga sumusunod na pangunahing hakbang: 1) pagkuha ng materyal at pag-aayos nito; 2) materyal compaction; 3) paghahanda ng mga seksyon; 4) paglamlam o contrasting na mga seksyon. Para sa light microscopy, kinakailangan ang isa pang hakbang - ang pagtatapos ng mga seksyon sa isang balsamo o iba pa

transparent na media (5). Pag-aayos tinitiyak ang pag-iwas sa mga proseso ng agnas, na tumutulong upang mapanatili ang integridad ng mga istruktura. Ito ay nakamit sa pamamagitan ng katotohanan na kinuha mula sa katawan maliit na sample alinman sa nahuhulog sa isang fixative (alkohol, formalin, mga solusyon ng mga asing-gamot ng mabibigat na metal, osmic acid, mga espesyal na pinaghalong pag-aayos), o sumailalim sa paggamot sa init. Sa ilalim ng pagkilos ng fixative, ang hindi maibabalik na coagulation ng mga protina ay nangyayari sa mga tisyu at organo, bilang isang resulta kung saan ang mahahalagang aktibidad ay huminto, at ang mga istraktura ay naging patay, naayos.

selyo Ang mga piraso, na kinakailangan para sa paghahanda ng mga seksyon, ay ginawa sa pamamagitan ng pag-aalis ng tubig sa mga alkohol ng pagtaas ng konsentrasyon at pagpapabinhi na may paraffin, celloidin, mga organikong resin. Ang mas mabilis na compaction ay nakakamit sa pamamagitan ng paggamit ng paraan ng pagyeyelo ng mga piraso, halimbawa sa likidong carbonic acid.

Paghahanda ng seksyon ay ginagawa gamit ang mga espesyal na device - microtomes at freezing microtomes, o cryostats (para sa light microscopy) at ultramicrotomes (para sa electron microscopy). Ang kapal ng slice para sa light-optical na pagsusuri ay mula 5 hanggang 20 µm, at para sa electron microscopy - mula 40 hanggang 100 nm. Para sa paghahambing, ang 1 mm ay katumbas ng 1000 microns at 1,000,000 nm.

Paglamlam ng seksyon(para sa light microscopy) o sputtering na may metal salts (para sa electron microscopy) ay ginagamit upang pataasin ang contrast ng imahe ng mga indibidwal na istruktura. Ang mga pamamaraan para sa paglamlam ng mga istrukturang histological ay napaka-magkakaibang at pinili depende sa mga layunin ng pag-aaral. Ang mga histological stain ay nahahati sa acidic, basic at neutral. Kabilang sa mga halimbawa ang pinakakilalang pangunahing pangulay, ang hematoxylin, na nagpapalamlam sa nuclei purple, at ang acidic na tina, eosin, na nagpapalamlam sa cytoplasm na pink-orange. Ang pumipili na pagkakaugnay ng mga istraktura para sa ilang mga tina ay dahil sa kanilang kemikal na komposisyon at pisikal na katangian. Ang mga istrukturang nabahiran ng mabuti ng mga acid dyes ay tinatawag oxyphilic(acidophilic, eosinophilic), at basic staining - basophilic. Ang mga istrukturang tumatanggap ng parehong acidic at basic na tina ay neutrophilic(heterophilic). May mga istruktura ng cell na nabahiran ng kulay na iba sa kulay ng ginamit na tina. Ang kababalaghang ito ay tinatawag metachromasia. Ang mga may kulay na paghahanda ay kadalasang inaalis ng tubig sa mga alkohol na lumalakas ang lakas at nililinis sa xylene, benzene, toluene, o ilang langis. Para sa pangmatagalang pangangalaga, isang dehydrated histological section ay nakapaloob sa pagitan ng slide at cover slip sa Canadian balsam o iba pang mga substance. Ang natapos na paghahanda sa histological ay maaaring gamitin para sa mikroskopikong pagsusuri sa loob ng maraming taon. Para sa electron microscopy, ang mga seksyon na nakuha gamit ang ultramicrotome ay inilalagay sa mga espesyal na grids, contrasted sa lead at cobalt salts, at pagkatapos ay tiningnan sa ilalim ng mikroskopyo at kinunan ng larawan. Ang mga nakuhang microphotograph ay nagsisilbing object ng pag-aaral kasama ng histological paghahanda.
MGA PARAAN PARA SA PAG-AARAL NG MGA BUHAY NA SEL AT TISYU

Ang pag-aaral ng mga buhay na selula at tisyu ay nagbibigay-daan sa iyo upang makakuha ng pinaka kumpletong impormasyon tungkol sa kanilang aktibidad sa buhay - upang masubaybayan ang paggalaw, mga proseso ng paghahati, pagkasira, paglaki, pagkita ng kaibhan at pakikipag-ugnayan ng mga selula, ang tagal ng kanilang ikot ng buhay, mga reaktibong pagbabago bilang tugon. sa pagkilos ng iba't ibang mga kadahilanan.

Panghabambuhay na pag-aaral ng mga selula sa katawan(sa vivo). Ang isa sa mga mahahalagang pamamaraan ng pananaliksik ay ang pagmamasid sa mga istruktura sa isang buhay na organismo. Sa tulong ng mga espesyal na translucent microscopes-illuminators, halimbawa, posible na pag-aralan ang dynamics ng sirkulasyon ng dugo sa microvessels. Pagkatapos ng anesthesia sa isang hayop, ang bagay na pinag-aaralan (halimbawa, ang mesentery ng bituka) ay kinuha at sinusuri gamit ang isang mikroskopyo, habang ang mga tisyu ay dapat na patuloy na basa-basa ng isotonic sodium chloride solution. Gayunpaman, ang tagal ng naturang pagmamasid ay limitado. nangungunang mga marka nagbibigay ng isang paraan ng pagtatanim ng mga transparent na silid sa katawan ng isang hayop.

Ang pinaka-maginhawang organ para sa pagtatanim ng naturang mga camera at kasunod na pagmamasid ay ang tainga ng isang hayop (halimbawa, isang kuneho). Ang isang seksyon ng tainga na may isang transparent na silid ay inilalagay sa entablado ng mikroskopyo at sa ilalim ng mga kundisyong ito ang dinamika ng mga pagbabago sa mga selula at tisyu ay pinag-aaralan sa loob ng mahabang panahon. Sa ganitong paraan, maaaring pag-aralan ang mga proseso ng pagpapalayas ng leukocyte mula sa mga daluyan ng dugo, iba't ibang yugto pagbuo ng connective tissue, capillaries, nerves at iba pang proseso. Ang mata ng mga pang-eksperimentong hayop ay maaaring gamitin bilang isang natural na transparent na kamera. Ang mga cell, tissue, o organ sample ay inilalagay sa fluid ng anterior chamber ng mata sa anggulo na nabuo ng cornea at iris at sinusunod sa pamamagitan ng transparent na cornea. Kaya, ang paglipat ng isang fertilized na itlog ay isinasagawa at ang mga unang yugto ng pag-unlad ng embryo ay nasubaybayan. Ang mga unggoy ay inilipat sa maliliit na piraso ng matris at pinag-aralan ang mga pagbabago sa mauhog lamad nito sa iba't ibang yugto ng menstrual cycle.

Ang pamamaraan ay malawakang ginagamit mga transplant dugo at bone marrow cells mula sa malusog na donor na hayop hanggang sa mga hayop na tumatanggap na nalantad sa nakamamatay na radiation. Ang mga hayop na tumanggap pagkatapos ng paglipat ay nanatiling buhay dahil sa pagkaka-ukit ng mga donor cell na bumubuo ng mga kolonya ng hematopoietic cells sa spleen. Ang pag-aaral ng bilang ng mga kolonya at ang kanilang komposisyon ng cellular ay ginagawang posible upang matukoy ang bilang ng mga selulang hematopoietic ng magulang at ang iba't ibang yugto ng kanilang pagkita ng kaibhan. Gamit ang paraan ng pagbuo ng kolonya, ang mga mapagkukunan ng pag-unlad ng lahat ng mga selula ng dugo ay itinatag.

Vital at supravital staining. Sa mahalagang (panghabambuhay) na paglamlam ng mga selula at tisyu, ang pangulay ay itinuturok sa katawan ng hayop, habang pinipili nito ang ilang mga selula, ang kanilang mga organel o intercellular substance. Halimbawa, gamit ang trypan blue o lithium carmine, natukoy ang mga phagocytes, at gamit ang alizarin, isang bagong nabuong bone matrix.

supravital ang paglamlam ay tumutukoy sa paglamlam ng mga buhay na selula na nakahiwalay sa katawan. Sa ganitong paraan, ang mga batang anyo ng erythrocytes ay nakita - mga reticulocytes ng dugo (makikinang na cresyl blue dye), mitochondria sa mga selula (Janus green dye), lysosomes (neutral red dye).

Pag-aaral ng mga buhay na selula at tisyu sa kultura (savitro). Ang pamamaraang ito ay isa sa pinakakaraniwan. Ang mga cell na nakahiwalay sa katawan ng tao o hayop, maliliit na sample ng mga tisyu o organo ay inilalagay sa salamin o plastik na mga sisidlan na naglalaman ng isang espesyal na nutrient medium - plasma ng dugo, embryonic extract, pati na rin ang artipisyal na media.

May mga suspension culture (mga cell na nasuspinde sa medium), tissue, organ at monolayer culture (explanted cells na bumubuo ng tuluy-tuloy na layer sa salamin). Ang sterility ng daluyan at ang temperatura na naaayon sa temperatura ng katawan ay sinisiguro. Sa ilalim ng mga kondisyong ito, ang mga cell sa loob ng mahabang panahon ay nagpapanatili ng mga pangunahing tagapagpahiwatig ng mahahalagang aktibidad - ang kakayahang lumaki, magparami, magkaiba, at lumipat. Ang ganitong mga kultura ay maaaring umiral nang maraming araw, buwan, at kahit na taon kung ang medium ng kultura ay na-renew at ang mga mabubuhay na selula ay inilipat sa ibang mga sisidlan. Ang ilang mga uri ng mga cell, dahil sa mga pagbabago sa kanilang genome, ay maaaring magpatuloy at dumami sa kultura, na bumubuo ng tuluy-tuloy na mga linya ng cell. A. A. Maksimov, A. V. Rumyantsev, N. G. Khlopin, A. D. Timofeevsky, at F. M. Lazarenko ay gumawa ng malaking kontribusyon sa pagbuo ng mga pamamaraan para sa paglilinang ng mga selula at tisyu. Sa kasalukuyan, ang mga cell line ng fibroblast, myocytes, epitheliocytes, at macrophage ay nakuha, na umiral nang maraming taon.

Ang paggamit ng paraan ng paglilinang ay naging posible upang makilala ang isang bilang ng mga pattern ng pagkita ng kaibhan, malignant na pagbabago ng mga cell, mga pakikipag-ugnayan ng mga cell na may mga virus at microbes. Ang pamamaraan ng tissue culture ay partikular na kahalagahan para sa mga eksperimentong obserbasyon. Ang mga cell na kinuha mula sa katawan ng tao sa panahon ng pagbutas o biopsy ay maaaring gamitin sa tissue culture upang matukoy ang kasarian, namamana na mga sakit, malignant na pagkabulok, at upang matukoy ang mga epekto ng isang bilang ng mga nakakalason na sangkap.

Ang mga cell culture ay malawakang ginagamit para sa cell hybridization.

Ang mga pamamaraan ay binuo para sa paghihiwalay ng mga tisyu sa mga cell, paghihiwalay ng mga indibidwal na uri ng cell at pag-kultura sa kanila. Una, ang tissue ay na-convert sa isang cell suspension sa pamamagitan ng pagsira sa mga intercellular contact at ang extracellular matrix sa tulong ng proteolytic enzymes(trypsin, collagenase) at mga compound na nagbubuklod sa Ca 2+ (gamit ang EDTA - ethylenediaminetetraacetate). Dagdag pa, ang nagresultang suspensyon ay pinaghihiwalay sa mga fraction ng mga cell ng iba't ibang uri gamit ang centrifugation, na nagpapahintulot sa paghihiwalay ng mas mabibigat na mga cell mula sa mas magaan, malaki mula sa maliliit, o sa pamamagitan ng pagdikit ng mga cell sa salamin o plastik, ang kakayahan nito ay naiiba para sa iba't ibang uri ng mga selula. Upang matiyak ang tiyak na pagdirikit ng mga cell sa ibabaw ng salamin, ginagamit ang mga antibodies na partikular na nagbubuklod sa mga selula ng parehong uri. Ang mga nakadikit na selula ay pagkatapos ay pinaghihiwalay, sinisira

matrix na may mga enzyme, kaya nakakakuha ng suspensyon ng mga homogenous na selula. Ang isang mas banayad na paraan ng paghihiwalay ng cell ay ang pag-label ng mga antibodies na nakatali sa mga fluorescent dyes. Ang mga cell na may label ay pinaghihiwalay mula sa mga cell na walang label gamit ang isang sorter (electronic fluorescence-activated cell analyzer). Ang cell analyzer ay nag-uuri ng humigit-kumulang 5000 na mga cell sa loob ng 1 segundo. Maaaring pag-aralan ang mga nakahiwalay na selula sa ilalim ng mga kondisyon ng kultura.

Ang paraan ng paglilinang ng cell ay ginagawang posible na pag-aralan ang kanilang mahahalagang aktibidad, pagpaparami, pagkita ng kaibhan, pakikipag-ugnayan sa ibang mga selula, atbp.

Karaniwang inihahanda ang mga kultura mula sa isang suspensyon ng cell na inihanda ng paraan ng paghihiwalay ng tissue na inilarawan sa itaas. Karamihan sa mga cell ay hindi maaaring lumaki sa pagsususpinde; kailangan nila matigas na ibabaw, na ginagamit bilang ibabaw ng isang plastic culture dish, kung minsan ay may mga bahagi ng extracellular matrix, tulad ng collagen. Ang mga pangunahing kultura ay tinatawag na mga kultura na inihanda kaagad pagkatapos ng unang yugto ng cell fractionation, pangalawang - cell culture na inilipat mula sa pangunahing pananim sa isang bagong kapaligiran. Ang mga cell ay maaaring i-transplant nang sunud-sunod sa loob ng mga linggo at buwan, habang ang mga cell ay nagpapanatili ng kanilang mga katangiang histogenetic features (halimbawa, ang mga epithelial cell ay bumubuo ng mga layer). Ang panimulang materyal para sa mga kultura ng cell ay karaniwang pangsanggol at neonatal na tisyu.

Ang mga pinaghalong asing-gamot, amino acids, bitamina, blood serum, chicken embryo extract, embryonic serum, atbp. ay ginagamit bilang nutrient media. Ang espesyal na media ay binuo para sa paglilinang ng iba't ibang uri ng cell. Naglalaman ang mga ito ng isa o higit pang mga salik sa paglaki ng protina na kinakailangan para mabuhay at magparami ang mga selula. Halimbawa, para sa paglago mga selula ng nerbiyos kailangan ang nerve growth factor.

Karamihan sa mga cell sa kultura ay may tiyak na bilang ng mga dibisyon (50-100), at pagkatapos ay mamamatay sila. Minsan lumilitaw ang mga mutant na selula sa kultura, na dumarami nang walang hanggan at bumubuo ng isang linya ng cell (fibroblast, epitheliocytes, myoblast, atbp.). Ang mga mutant na selula ay iba sa mga selula ng kanser, na may kakayahang patuloy na paghahati, ngunit ang mga selula ay lumalaki nang hindi nakakabit sa isang solidong ibabaw. Ang mga selula ng kanser sa mga pagkaing pangkultura ay bumubuo ng mas siksik na populasyon kaysa sa mga normal na populasyon ng selula. Ang isang katulad na pag-aari ay maaaring ma-induce sa eksperimento sa mga normal na selula sa pamamagitan ng pagbabago sa kanila ng mga virus na nagdadala ng tumor o mga kemikal na compound, na nagreresulta sa pagbuo ng mga neoplastic na transformed na linya ng cell. Ang mga linya ng cell ng mga hindi nabago at nabagong mga cell ay maaaring maimbak nang mahabang panahon sa mababang temperatura (-70 °C). Ang genetic homogeneity ng mga cell ay pinahusay sa pamamagitan ng cloning, kapag ang isang malaking kolonya ng homogenous na mga cell ay nakuha mula sa isang cell sa panahon ng sunud-sunod na paghahati nito. Ang clone ay isang populasyon ng mga cell na nagmula sa iisang progenitor cell.

mga hybrid ng cell. Kapag nagsanib ang dalawang selula ng magkaibang uri, nabuo ang isang heterokaryon - isang selulang may dalawang nuclei. Upang makakuha ng heterokaryon, ang isang cell suspension ay ginagamot ng polyethylene glycol o mga inactivated na virus upang makapinsala sa mga cell plasmolemms, pagkatapos kung saan ang mga cell ay may kakayahang mag-fusion. Halimbawa, ang hindi aktibong nucleus ng isang chicken erythrocyte ay nagiging aktibo (RNA synthesis, DNA replication) kapag ang mga cell ay nagsanib at inilipat sa cytoplasm ng isa pang cell na lumalaki sa tissue culture. Ang heterocaryon ay may kakayahang mitosis, na nagreresulta sa pagbuo ng isang hybrid

cell. Ang mga shell ng nuclei ng heterokaryon ay nawasak, at ang kanilang mga chromosome ay pinagsama sa isang malaking nucleus.

Ang pag-clone ng mga hybrid na selula ay humahantong sa pagbuo ng mga hybrid na linya ng cell na ginagamit upang pag-aralan ang genome. Halimbawa, sa isang mouse-human hybrid cell line, ang papel ng human chromosome 11 sa synthesis ng insulin ay naitatag.

Mga hybrid. Ang mga linya ng Hybridoma cell ay ginagamit upang makakuha ng mga monoclonal antibodies. Ang mga antibodies ay ginawa ng mga selula ng plasma, na nabuo mula sa B-lymphocytes sa panahon ng pagbabakuna. Ang isang tiyak na uri ng antibody ay nakukuha sa pamamagitan ng pagbabakuna sa mga daga na may mga tiyak na antigens. Kung ang mga naturang immunized lymphocytes ay na-clone, isang malaking halaga ng homogenous antibodies ang maaaring makuha. Gayunpaman, ang buhay ng B-lymphocytes sa kultura ay limitado. Samakatuwid, sumanib sila sa mga "walang kamatayan" na mga selula ng tumor (B-lymphomas). Bilang resulta, ang mga hybridoma ay nabuo (isang hybrid na selula na may genome mula sa dalawang magkaibang mga selula; ang oma ay ang nagtatapos sa mga pangalan ng mga tumor). Ang ganitong mga hybridoma ay maaaring dumami nang mahabang panahon sa kultura at mag-synthesize ng mga antibodies. isang tiyak na uri. Ang bawat hybridoma clone ay pinagmumulan ng monoclonal antibodies. Ang lahat ng antibody molecule ng isang partikular na species ay may parehong antigen-binding specificity. Posibleng makabuo ng mga monoclonal antibodies laban sa anumang protina na nakapaloob sa isang cell at gamitin ang mga ito upang i-localize ang mga protina sa isang cell, gayundin upang ihiwalay ang isang protina mula sa isang pinaghalong (protein purification), na nagpapahintulot sa isa na pag-aralan ang istraktura at paggana ng mga protina. . Ginagamit din ang mga monoclonal antibodies sa teknolohiya ng pag-clone ng gene.

Ang mga antibodies ay maaaring gamitin upang pag-aralan ang pag-andar ng iba't ibang mga molekula sa pamamagitan ng pagpapakilala sa kanila sa pamamagitan ng plasmalemma nang direkta sa cytoplasm ng mga cell na may manipis na glass pipette. Halimbawa, ang pagpapakilala ng mga antibodies sa myosin sa cytoplasm ng isang fertilized na itlog sea ​​urchin pinipigilan ang paghahati ng cytoplasm.

Recombinant na teknolohiya ng DNA. Ginagawang posible ng mga klasikal na pamamaraang genetic na pag-aralan ang pag-andar ng mga gene sa pamamagitan ng pagsusuri sa mga phenotype ng mga mutant na organismo at kanilang mga supling. Ang teknolohiya ng recombinant na DNA ay umaakma sa mga pamamaraang ito, na nagbibigay-daan para sa detalyadong pagsusuri ng kemikal genetic na materyal at tumanggap ng malalaking halaga ng mga cellular protein.

Ang mga pamamaraan ng hybridization ay malawakang ginagamit sa modernong biology upang pag-aralan ang istruktura ng mga gene at ang kanilang pagpapahayag.

MGA PARAAN PARA SA PAG-AARAL NG KOMPOSISI NG KEMIKAL AT METABOLISMO NG MGA CELLS AT TISSUES

Upang pag-aralan ang kemikal na komposisyon ng mga biological na istruktura - ang lokalisasyon ng mga sangkap, ang kanilang konsentrasyon at dinamika sa mga proseso ng metabolic, ang mga espesyal na pamamaraan ng pananaliksik ay ginagamit.

Cyto- at histochemical na pamamaraan. Ginagawang posible ng mga pamamaraang ito na makita ang lokalisasyon ng iba't ibang mga kemikal sa mga istruktura ng mga selula, tisyu at organo.

bago - DNA, RNA, protina, carbohydrates, lipids, amino acids, mineral, bitamina, aktibidad ng enzyme. Ang mga pamamaraan na ito ay batay sa pagtitiyak ng reaksyon sa pagitan ng isang kemikal na reagent at isang substrate na bahagi ng mga istruktura ng cellular at tissue, at sa paglamlam ng mga produkto ng reaksyong kemikal. Ang mga naaangkop na enzyme ay kadalasang ginagamit upang kontrolin ang pagtitiyak ng reaksyon. Halimbawa, para makita ang ribonucleic acid (RNA) sa mga cell, kadalasang ginagamit ang gallocyanine, isang dye na may mga pangunahing katangian, at ang pagkakaroon ng RNA ay kinumpirma ng control treatment na may RNA-cleaving ribonuclease. Binabahiran ng Gallocyanin ang RNA blue-violet. Kung ang seksyon ay pre-treat na may ribonuclease at pagkatapos ay nabahiran ng gallocyanin, kung gayon ang kawalan ng paglamlam ay nagpapatunay sa pagkakaroon ng ribonucleic acid sa istraktura. Maraming mga cyto- at histochemical na pamamaraan ang inilarawan sa mga partikular na manwal.

Ang kumbinasyon ng mga pamamaraan ng histochemical sa pamamaraan ng electron microscopy ay humantong sa pagbuo ng isang bagong promising na direksyon - elektronikong histochemistry. Ginagawang posible ng pamamaraang ito na pag-aralan ang lokalisasyon ng iba't ibang mga kemikal hindi lamang sa cellular, kundi pati na rin sa mga antas ng subcellular at molekular. Upang pag-aralan ang mga macromolecule ng cell, ang mga napakasensitibong pamamaraan ay ginagamit gamit ang mga radioactive isotopes at antibodies, na ginagawang posible upang makita ang kahit na isang maliit na nilalaman ng mga molekula (mas mababa

Ang mga radioactive isotopes sa panahon ng pagkabulok ng nucleus ay naglalabas ng mga sisingilin na particle (mga electron) o radiation (halimbawa, gamma ray), na maaaring makita ng mga espesyal na aparato. Ang radioactive isotopes ay ginagamit sa radioautography. Halimbawa, sa tulong ng radioisotopes ng 3 H-thymidine, ang nuclear DNA ay sinusuri, sa tulong ng 3 H-uridine - RNA.

paraan ng radioautographic. Ginagawang posible ng pamamaraang ito na lubos na pag-aralan ang metabolismo sa iba't ibang istruktura. Ang pamamaraan ay batay sa paggamit ng mga radioactive na elemento (halimbawa, phosphorus 32 P, carbon 14 C, sulfur 35 S, hydrogen 3 H) o mga compound na may label ng mga ito. Ang mga radioactive substance sa histological na mga seksyon ay nakita gamit ang isang photographic emulsion, na inilapat sa paghahanda at pagkatapos ay binuo. Sa mga lugar ng paghahanda kung saan ang photographic emulsion ay nakikipag-ugnayan sa radioactive substance, photoreaction, bilang isang resulta kung saan ang mga iluminado na lugar (mga track) ay nabuo. Maaaring gamitin ang pamamaraang ito upang matukoy, halimbawa, ang rate ng pagsasama ng mga may label na amino acid sa mga protina, ang pagbuo ng mga nucleic acid, metabolismo ng yodo sa mga thyroid cell, atbp.

Mga pamamaraan ng immunofluorescent at immunocytochemical analysis. Ang paggamit ng mga antibodies. Ang mga antibodies ay mga proteksiyon na protina na ginawa ng mga selula ng plasma (mga derivatives ng B-lymphocytes) bilang tugon sa pagkilos ng mga dayuhang sangkap (antigens). Dami iba't ibang anyo ang mga antibodies ay umabot sa isang milyon. Ang bawat antibody ay may mga site para sa "pagkilala" ng mga molecule na naging sanhi ng synthesis ng antibody na ito. Dahil sa mataas na pagtitiyak ng mga antibodies para sa mga antigen, maaari silang magamit upang makita ang anumang mga protina ng cell. Ang pamamaraan ay batay sa mga reaksyon ng antigen-antibody. Ang bawat cell ng katawan ay may isang tiyak na antigenic komposisyon, na kung saan ay ang pangunahing

nimuly tinutukoy ng mga protina. Upang mapahusay ang pagtitiyak ng reaksyon, ginagamit ang mga monoclonal antibodies, na nabuo ng isang cell line - mga clone (isang linya - isang clone), na nakuha ng hybridoma na paraan mula sa isang cell. Ginagawang posible ng paraan ng hybridoma na makakuha ng mga monoclonal antibodies na may parehong pagtitiyak at sa walang limitasyong dami. Maaaring gamitin ang mga antibodies upang pag-aralan ang mga antigen sa parehong antas ng liwanag at ultrastructural gamit ang isang electron microscope. AT mga klinikal na diagnostic Ang mga pamamaraan ng immunohistochemistry sa mga seksyon ng paraffin ay malawakang ginagamit. Ang isang malaking bilang ng mga molecular marker at mga pamamaraan para sa pag-detect ng mga intermediate na filament na protina, proliferative, pagkita ng kaibahan at apoptotic na protina sa mga cell ay iminungkahi. Upang gawing pamantayan ang pagproseso ng mga paghahanda, ginagamit ang isang immunostainer - isang aparato kung saan ang lahat ng mga operasyon ay isinasagawa nang walang interbensyon mula sa mananaliksik.

Ang mga paraan ng immunofluorescent at immunohistochemical analysis ay malawak at epektibong ginagamit sa siyentipikong pananaliksik at sa mga diagnostic sa laboratoryo. Ang mga produkto ng reaksyon ay maaaring mabahiran ng mga fluorescent dyes at matukoy gamit ang isang fluorescent microscope, o maaaring gumamit ng mga espesyal na reagent kit na mantsa sa mga protina na pinag-aaralan at sinusuri gamit ang isang light microscope. Ang mga pamamaraang ito ay ginagamit upang pag-aralan ang mga proseso ng pagkita ng kaibhan ng cell, upang matukoy ang mga partikular na kemikal na compound at istruktura sa mga ito. Ginagawang posible ng mga pamamaraan na makilala ang functional na estado ng mga cell na may mataas na katumpakan, kilalanin ang histogenetic affiliation at pagbabago ng cell sa mga sakit na oncological.

Fractionation ng mga nilalaman ng cellular. Ang mga istruktura ng cell at macromolecule ay maaaring i-fractionated iba't ibang pamamaraan- ultracentrifugation, chromatography, electrophoresis. Ang mga pamamaraang ito ay inilarawan nang mas detalyado sa mga aklat-aralin ng biochemistry.

Ultracentrifugation. Gamit ang pamamaraang ito, ang mga cell ay maaaring nahahati sa mga organelles at macromolecules. Una, ang mga cell ay nawasak sa pamamagitan ng osmotic shock, ultrasound, o mekanikal na pagkilos. Sa kasong ito, ang mga lamad (plasmolemma, endoplasmic reticulum) ay nahahati sa mga fragment, kung saan nabuo ang pinakamaliit na vesicle, at ang nuclei at organelles (mitochondria, Golgi complex, lysosomes at peroxisomes) ay nananatiling buo at nasa pagbuo ng suspensyon.

Ang isang high-speed centrifuge (80,000-150,000 rpm) ay ginagamit upang paghiwalayin ang mga bahagi ng cell sa itaas. Una, ang malalaking bahagi (nuclei, cytoskeleton) ay tumira (sedimentate) sa ilalim ng tubo. Sa karagdagang pagtaas sa bilis ng centrifugation ng mga supernatant fraction, ang mas maliliit na particle ay sunod-sunod na tumira - una mitochondria, lysosomes at peroxisomes, pagkatapos ay microsomes at ang pinakamaliit na vesicle, at sa wakas ay ribosomes at malalaking macromolecules. Sa panahon ng centrifugation, ang iba't ibang mga fraction ay tumira sa iba't ibang mga rate, na bumubuo ng hiwalay na mga banda sa test tube, na maaaring ihiwalay at suriin. Malawak ang mga fractionated cell extract (mga cell-free system).

Ang ko ay ginagamit upang pag-aralan ang mga proseso ng intracellular, halimbawa, upang pag-aralan ang biosynthesis ng protina, tukuyin ang genetic code, atbp.

Chromatography malawakang ginagamit para sa fractionation ng protina.

electrophoresis nagbibigay-daan sa iyo na paghiwalayin ang mga molekula ng protina na may iba't ibang singil kapag inilagay mo ang mga ito may tubig na solusyon(o sa isang solid porous matrix) sa isang electric field.

Ang mga pamamaraan ng Chromatography at electrophoresis ay ginagamit upang pag-aralan ang mga peptide na nakuha sa pamamagitan ng paghahati ng isang molekula ng protina at upang makuha ang tinatawag na mga mapa ng peptide ng mga protina. Ang mga pamamaraang ito ay inilarawan nang detalyado sa mga aklat-aralin sa biochemistry.

Ang pag-aaral ng kemikal na komposisyon ng mga buhay na selula. Upang pag-aralan ang pamamahagi ng mga sangkap at ang kanilang metabolismo sa mga buhay na selula, ginagamit ang nuclear magnetic resonance at microelectrode techniques.

Nuclear magnetic resonance nagbibigay-daan sa iyo na pag-aralan ang maliliit na molekula ng mababang molekular na timbang na mga sangkap. Ang sample ng tissue ay naglalaman ng mga atomo na nailalarawan sa kanilang kakayahang sumipsip ng enerhiya sa iba't ibang uri resonant frequency. Ang isang absorption diagram sa mga resonant frequency para sa isang naibigay na sample ay bubuo sa NMR spectrum nito. Sa biology, ang signal ng NMR mula sa mga proton (hydrogen nuclei) ay malawakang ginagamit sa pag-aaral ng mga protina, nucleic acid, atbp. subaybayan ang pagbabago nito sa panahon ng mga selula ng buhay. Kaya, ang phosphorus isotope ay ginagamit upang pag-aralan ang pag-urong ng kalamnan - mga pagbabago sa nilalaman ng ATP at inorganic phosphate sa mga tisyu. Ginagawang posible ng carbon isotope na pag-aralan ang maraming proseso kung saan kasangkot ang glucose gamit ang NMR. Ang paggamit ng NMR ay limitado sa pamamagitan ng mababang sensitivity nito: 1 g ng buhay na tissue ay dapat maglaman ng hindi bababa sa 0.2 mmol ng pagsubok na sangkap. Ang bentahe ng pamamaraan ay ang pagiging hindi nakakapinsala sa mga buhay na selula.

Teknolohiya ng microelectrode. Ang mga microelectrodes ay mga glass tube na puno ng isang electrically conductive solution (karaniwan ay isang solusyon ng KC1 sa tubig), ang dulo ng diameter nito ay sinusukat sa mga fraction ng isang micrometer. Ang dulo ng naturang tubo ay maaaring ipasok sa cytoplasm ng cell sa pamamagitan ng lamad ng plasma at matukoy ang konsentrasyon ng H+, Na+, K+, C1 -, Ca 2 +, Mg 2 + ions, ang potensyal na pagkakaiba sa lamad ng plasma, at nag-iniksyon din ng mga molecule sa cell. Upang matukoy ang konsentrasyon ng isang partikular na ion, ang mga ion-selective electrodes ay ginagamit, na puno ng isang ion-exchange resin na natatagusan lamang para sa ion na ito. Ang pamamaraan ng microelectrode ay ginagamit upang pag-aralan ang transportasyon ng mga ion sa pamamagitan ng mga espesyal na channel ng ion (mga espesyal na channel ng protina) sa plasmalemma. Sa kasong ito, ginagamit ang isang microelectrode, na mahigpit na pinindot laban sa kaukulang seksyon ng plasmalemma. Ang pamamaraang ito ay nagpapahintulot sa isa na pag-aralan ang pag-andar ng isang molekula ng protina. Ang pagbabago sa konsentrasyon ng mga ion sa loob ng cell ay maaaring matukoy gamit ang mga luminescent indicator. Halimbawa, upang pag-aralan ang intracellular na konsentrasyon ng Ca 2+, ginagamit ang luminescent protein aquarin (nahihiwalay sa dikya), na nagpapalabas ng liwanag sa pagkakaroon ng mga Ca 2+ ions at tumutugon sa mga pagbabago sa konsentrasyon ng huli sa hanay ng 0.5-10 μmol. Ang mga fluorescent indicator ay na-synthesize din na malakas na nagbubuklod sa Ca 2+ . Paglikha ng iba't ibang mga bagong uri ng intracellular indicator at makabagong paraan Ang pagsusuri ng imahe ay nagpapahintulot sa iyo na tumpak at mabilis na matukoy ang intracellular na konsentrasyon ng maraming mababang molekular na timbang na mga sangkap.

MARAMING PARAAN

Sa kasalukuyan, kasama ang mga pamamaraan ng husay, ang mga pamamaraan ng quantitative histochemical ay binuo at ginagamit para sa pagtukoy ng nilalaman ng iba't ibang mga sangkap sa mga cell at tisyu. Ang isang tampok ng quantitative histochemical (kumpara sa biochemical) na mga pamamaraan ng pananaliksik ay ang posibilidad ng pag-aaral ng konsentrasyon ng mga sangkap ng kemikal sa mga tiyak na istruktura ng cell at tissue.

Cytospectrophotometry- isang paraan para sa pag-aaral ng kemikal na komposisyon ng isang cell, batay sa pumipili na pagsipsip ng ilang mga sangkap ng mga sinag na may isang tiyak na haba ng daluyong. Ang intensity ng pagsipsip ng monochromatic light, na nakasalalay sa konsentrasyon ng sangkap, ay tumutukoy sa nilalaman nito sa cell. Halimbawa, tinutukoy ang nilalaman ng DNA sa nucleus, RNA at kabuuang protina sa cytoplasm, atbp.

Cytospectrofluorometry- isang paraan para sa dami ng pag-aaral ng mga intracellular substance sa pamamagitan ng kanilang fluorescence spectra o sa pamamagitan ng fluorescence intensity kapag ang paghahanda ay na-irradiated na may pre-selected light wavelength (cytofluorometry). Sa kasong ito, ginagamit ang mga fluorochrome, na dami na nagbubuklod sa mga sangkap ng cell (DNA, RNA, protina, atbp.).

Ang mga modernong mikroskopyo - ang mga cytofluorimeter ay ginagawang posible na makita ang maliit na halaga ng mga sangkap sa iba't ibang mga istraktura (hanggang sa 10 -14 -10 -16 g) at upang masuri ang lokalisasyon ng mga sangkap na pinag-aaralan sa mga microstructure.

Interferometry. Ginagawang posible ng pamamaraang ito na tantyahin ang tuyong masa at ang konsentrasyon ng mga siksik na sangkap sa mga nabubuhay at nakapirming mga selula. Gamit ang pamamaraang ito, halimbawa, posible na maitatag ang kabuuang nilalaman ng mga protina sa nabubuhay at nakapirming mga selula.

MGA PARAAN NG PAGSUSURI NG LARAWAN NG MGA ISTRUKTURA NG CELL AT TISSUE

Ang nakuha na mga larawan ng mga microobject sa isang mikroskopyo, sa isang display screen, sa mga electron micrograph ay maaaring sumailalim sa espesyal na pagsusuri - ang pagkakakilanlan ng morphometric, densitometric na mga parameter at ang kanilang statistical processing. Ang mga pamamaraan ng Morphometric ay ginagawang posible upang matukoy sa tulong ng mga espesyal na grids (E. Veibel, A. A. Glagolev, S. B. Stefanova) ang bilang ng anumang mga istraktura, ang kanilang mga cross-sectional na lugar, diameters, atbp. Sa partikular, ang mga lugar ng nuclei, cytoplasm, ang kanilang mga diameter, nuclear-cytoplasmic ratios, atbp. Mayroong manu-manong morphometry at automated morphometry, kung saan ang lahat ng mga parameter ay awtomatikong sinusukat at naitala sa device.

Lalong lumaganap ang mga mga awtomatikong sistema pagpoproseso ng imahe (ACOIS), na ginagawang posible na pinaka-epektibong ipatupad ang mga pamamaraan ng dami sa itaas para sa pag-aaral ng mga cell at tissue. Kasabay nito, ang mga analytical na kakayahan ng quantitative microscopy ay pupunan ng mga pamamaraan ng pagsusuri at pagkilala ng mga sample batay sa

nym sa pagproseso sa tulong ng mga elektronikong computer (computers) na impormasyon na nakuha mula sa mga larawan ng mga cell at tissue. Sa esensya, maaari nating pag-usapan ang tungkol sa mga device na hindi lamang nagpapahusay sa mga optical na kakayahan ng visual analyzer ng tao, ngunit lubos ding nagpapalawak ng mga analytical na kakayahan nito. Ito ay nagpapahintulot sa iyo na makatanggap bagong impormasyon tungkol sa dati nang hindi natukoy na mga proseso, upang imodelo at mahulaan ang kanilang pag-unlad sa mga selula at tisyu.

Kasabay nito, ang pakikilahok sa isang eksperimento sa computer ay nangangailangan ng isang bagong diskarte mula sa mananaliksik sa pagpapatupad nito, mga kasanayan sa pag-compile ng mga algorithm para sa proseso ng pananaliksik, katumpakan ng pangangatwiran, at, sa huli, pagtataas ng siyentipiko at metodolohikal na antas ng pananaliksik.

Kaya, ang aplikasyon ng mga bagong pamamaraan ng pananaliksik sa histology, cytology at embryology ay ginagawang posible na ipaliwanag ang pangkalahatang mga pattern ng organisasyon ng mga tisyu at mga cell, ang mga istrukturang pundasyon ng mga biochemical na proseso na tumutukoy sa pag-andar ng mga tiyak. mga bahagi ng istruktura mga selula.
bahagi 1

Ang mga pangunahing pamamaraan ng cytological studies ay light at electron microscopy, ibig sabihin, ang paggamit ng mga light at electron microscope na nagbibigay-daan sa iyong makita ang panlabas at panloob na istraktura ng mga cell.

Ginagawang posible ng mga light microscope, bukod sa iba pang mga bagay, na obserbahan ang mga buhay na selula (karaniwan mga unicellular na organismo, mga selula ng dugo). Gayunpaman, ang resolution ng light microscopes ay hindi kasing taas ng electron microscopes. Ang resolution ng isang magnifying device ay ang pinakamababang distansya sa pagitan ng dalawang punto na makikita nang hiwalay. Para sa mga light microscope, ang distansyang ito ay sinusukat sa daan-daang nanometer, at para sa mga electron microscope, sa sampu at unit ng nanometer. Kung ang una ay gumagamit ng maliwanag na pagkilos ng bagay (ang resolution ay inversely proportional sa wavelength), ang huli ay gumagamit ng flux ng mga electron.

Mayroong dalawang uri ng electron microscopes - transmission at scanning. Ang resolution ng una ay medyo mas mataas, ngunit sa tulong ng huli, ang isang three-dimensional na imahe ay maaaring makuha. Para sa mga mikroskopyo ng transmisyon, ang mga napakanipis na seksyon ay inihanda kung saan dumadaan ang electron beam. Sa pag-scan ng mga mikroskopyo, ang isang electron beam ay makikita mula sa isang bagay.

AT pag-aaral ng cytological x ay ginagamit din pamamaraan ng fluorescence microscopy, na nakasalalay sa katotohanan na ang ilang mga sangkap ng pangkulay ay idinagdag sa mga buhay na selula, na, kapag pinagsama sa iba't ibang bahagi ng selula, ay nagsisimulang lumiwanag. Kaya, ang mga istruktura ng cell (chloroplast, microtubule, atbp.) ay maaaring maobserbahan sa isang light microscope.

Bilang karagdagan sa mikroskopya, ang iba pang mga pamamaraan ng pananaliksik ay ginagamit sa modernong cytology. Paraan ng cytochemical nagpapahintulot sa iyo na pag-aralan ang kemikal na komposisyon ng mga selula. Ang pamamaraang ito ay batay sa mga reaksiyong kemikal ng ilang mga sangkap. Sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mga reagents sa mga cell, posible na makita ang pagkakaroon ng DNA, ilang mga protina, atbp sa kanila, pati na rin upang matukoy ang kanilang halaga.

Paraan ng autograpi ng radyo nagsasangkot ng pagpapakilala ng isang sangkap na naglalaman ng mga may label na (radioactive) atoms. Pagkaraan ng ilang oras, ang mga may label na molekula ay kasama sa mga biopolymer ng cell, at maaari silang magamit upang subaybayan ang kurso ng mga metabolic na proseso sa cell.

Mula noong 20s ng XX siglo, tulad ng isang paraan ng cytological pananaliksik bilang centrifugation (o paraan ng fractionating cell structures). Ito ay batay sa katotohanan na ang mga istruktura ng cell ay may iba't ibang masa at idineposito sa iba't ibang mga rate sa panahon ng centrifugation. Kaya, kung ang mga cell ay nawasak, pagkatapos pagkatapos ng centrifuge ang halo ay nahahati sa mga praksyon, kung saan sa ibaba ay magkakaroon ng mas mabibigat na mga istraktura (karaniwang cell nuclei), at sa itaas - mas magaan.

Medyo bago ay pamamaraan ng kultura ng cell, na nagpapahintulot sa paglaki ng magkaparehong mga selula (mga kolonya) mula sa isa o higit pang mga unang selula sa labas ng katawan sa ilalim ng mga espesyal na nilikhang kondisyon. Ginagawang posible ng pamamaraang ito na pag-aralan ang mga katangian ng mga selula nito nang hiwalay mula sa katawan, upang magsagawa ng cytological, genetic at iba pang mga pag-aaral.

Ang isang bagong paraan ng cytological research ay pamamaraan ng microsurgery. Sa tulong ng isang micromanipulator na konektado sa isang mikroskopyo, ang iba't ibang mga bahagi ay nakuha o ipinakilala mula sa mga cell, ang mga sangkap ay ipinakilala.

Ang aklat-aralin ay nagtatanghal ng materyal sa lahat ng mga seksyon ng cytology, kabilang ang kasaysayan at modernong pamamaraan ng pag-aaral ng mga cell, ang mga konsepto ng pagkita ng kaibhan at mga stem cell, ang mga klasikal na ideya ng cytology ay pupunan ng modernong data na nakuha sa lugar na ito sa huling dekada, ang mga problema ng Ang patolohiya ng cell ay sinusuri, sa partikular, ang mga modernong pananaw sa mga proseso ng nekrosis, apoptosis, ang biology ng mga selula ng kanser ay isinasaalang-alang. Ang aklat-aralin ay nagpapakita ng kabanata na "Gabay sa mga praktikal na pagsasanay sa Cytology", na maikling binabalangkas ang materyal ng 18 praktikal na pagsasanay. Ang aklat-aralin ay inilaan para sa mga bachelor ng biological faculties ng mga unibersidad at mga guro ng biology.

Kabanata 2. Mga pamamaraan ng modernong cytology

Cytochemistry

Ang pagbuo ng microtechnology ay aktibong nag-ambag sa akumulasyon ng data sa pinong cellular na istraktura. Sa pagtatapos ng ika-19 na siglo, salamat sa pagbuo ng mga pamamaraan para sa espesyal na paglamlam ng mga istruktura ng cellular sa liwanag na antas ng mikroskopya, ang Golgi reticular apparatus at mitochondria ay nakilala at inilarawan sa mga cell. Mas malapit sa kalagitnaan ng XX siglo. napakalaki mga publikasyong siyentipiko pagbubuod ng mga nagawa sa larangang ito. Ang larangan ng cytology, na pinag-aaralan ang nilalaman at pamamahagi ng mga compound ng kemikal sa loob ng cell, ang dinamika ng kanilang mga pagbabago sa kurso ng buhay, kabilang ang patolohiya, ay nagsimulang tawaging cytochemistry. Ang cytochemistry ay malawakang ginagamit ngayon. Ang isang malaking bilang ng mga diskarte sa paglamlam ay binuo na nagpapakita ng mga tiyak na compound ng kemikal sa cell, lalo na gamit ang mga fluorescent microscope.

Ang mga pamamaraan ng cytochemical ay nahahati sa dalawang malawak na kategorya. Kasama sa unang kategorya ang mga pamamaraan batay sa paggamit ng mga partikular na tina na nakikipag-ugnayan sa mga partikular na compound ng kemikal. Halimbawa, kapag nabahiran ng itim na Sudan, ang mga taba ay nakikita sa mga selula sa anyo ng mga itim na patak, habang ang mga istruktura ng nuclei at cytoplasmic ay nananatiling walang kulay (Larawan 2.1).

Ang pangalawang kategorya ng mga pamamaraan ng cytochemistry ay batay sa pagsasagawa ng isang kemikal na reaksyon nang direkta sa isang seksyon sa isang glass slide. Ang kakanyahan ng reaksyon ay upang i-hydrolyze ang pinag-aralan tambalang kemikal upang mabuo ang mga partikular na reaktibong grupo na nakikipag-ugnayan sa isang partikular na tina. Ang mga kondisyon ng hydrolysis para sa bawat compound ay pinili nang paisa-isa. Halimbawa, ang isang kupas na fuchsin base, na nakikipag-ugnayan sa mga grupo ng aldehyde, ay bumubuo ng isang malakas na tambalan, na nagiging pula sa pagkakaroon ng sulfurous acid.

kanin. 2.1. Pagtuklas ng taba sa axolotl liver cells na nabahiran ng itim na Sudan.

Ang isang klasikong halimbawa ay ang reaksyon ng Feulgen sa pagtuklas ng DNA. Sa kasong ito, ang hydrolysis ay isinasagawa sa 1M hydrochloric acid na may matagal na pag-init ng paghahanda. Bilang resulta ng reaksyon, ang purine nitrogenous base - adenine at guanine - ay nahiwalay mula sa molekula ng DNA. Sa kanilang lugar, ang mga libreng grupo ng aldehyde ay nabuo sa deoxyribose, na maaaring tumugon sa tina. Ang gamot pagkatapos ng reaksyon ay inilalagay sa isang solusyon sa pangulay. Ang pagbubuklod ng fuchsin ay nangyayari nang mahigpit sa dami. Pagkatapos hugasan ang paghahanda sa isang mahinang solusyon ng sulfurous acid, ang mga site ng lokalisasyon ng DNA ay nabahiran ng pula (Larawan 2.2a). Ang ganitong mga paghahanda ay maaaring gamitin upang mabilang ang DNA sa isang cell.

Upang makita ang glycogen polysaccharide, ang monomer na kung saan ay glucose, isang glass slide na may manipis na mga seksyon ng tissue ay inilalagay sa isang solusyon ng potassium periodate (KIO 4) at ang hydrolysis ay isinasagawa sa temperatura ng silid. Ang paggamot na ito ay humahantong sa pagkasira ng glycogen sa mga selula na may pag-activate ng mga grupo ng aldehyde sa molekula ng glucose. Ang paghahanda ay nabahiran sa parehong paraan tulad ng inilarawan para sa reaksyon ng DNA. Sa kasong ito, ang mga bahagi ng mga cell na naglalaman ng glycogen ay mabahiran. Ang partikular sa kasong ito ay hindi ang pangulay, ngunit ang pagpili ng naaangkop na reaksyon ng kemikal, na direktang isinasagawa sa paghahanda ng cytological (Fig. 2.2b).

kanin. 2.2. Ang pagtuklas ng DNA ayon sa Feulgen (a) at glycogen pagkatapos ng hydrolysis sa periodate (b) gamit ang decolorized fuchsin base. Mga selula ng atay ng Axolotl.

Sa tulong ng mga reaksyon ng kulay ng cytochemical sa mga cell, ang iba't ibang polysaccharides, mga tiyak na amino acid sa mga protina, nucleic acid, taba, lipid at maraming mga enzyme na kasangkot sa mga metabolic na proseso ng metabolismo at pagbabagong-anyo ng mga sangkap ay napansin. Ang mga enzyme ay karaniwang nakikilala sa pamamagitan ng pagkakaroon ng kanilang mga produkto ng aktibidad.

Sa kasalukuyan, ang mga fluorescent dyes ay malawakang ginagamit para sa tiyak na paglamlam ng mga biological polymers o cell organelles. Ang mga fluorochrome ay kilala sa pag-detect ng DNA, RNA, lipid, myotochondria, atbp. Ang fluorescent cytochemistry ay aktibong umuunlad.

Mga tanong

1. Ano ang cytochemistry?

2. Paano mabahiran ang DNA sa mga selula?

3. Paano matatagpuan ang glycogen sa mga selula? mataba?

Immunocytochemistry

Sa pagtatapos ng ika-20 siglo. ang cytochemistry ay lumipat sa isang bagong antas ng husay. Ang isang bagong direksyon sa cytochemistry, immunocytochemistry, na kasalukuyang isa sa mga pinaka-advanced na pamamaraan ng cell biology, ay matagumpay na binuo. Ang mga fluorescent microscope at fluorochrome dyes ay ginagamit para sa pamamaraang ito.

Kapag ginamit para sa immunocytochemistry, ang mga fluorochromes ay chemically "cross-linked" (conjugated) na may mga antibodies. Ang mga antibodies ay may pagtitiyak para sa isang partikular na protina, na nagsisilbing isang antigen, at hindi nakikipag-ugnayan sa anumang mga istruktura ng cellular, ngunit sa mga bahagi lamang ng mga selula kung saan matatagpuan ang protina na pinag-aaralan. Kaya, gamit ang paraan ng cytochemistry, posible na pag-aralan kung aling mga partikular na protina ang naisalokal sa ilang mga istruktura ng cellular.

Ang mga antibodies na ginagamit sa immunocytochemistry ay maaaring lagyan ng label, bilang karagdagan sa luminescent dyes, ng mga enzyme o electron-dense particle. Sa pagbabagong ito ng pamamaraan, ang pagkilala sa mga tiyak na protina ay isinasagawa gamit ang isang electron microscope.

Gamit ang paraan ng immunocytochemistry, ang komposisyon at pag-aayos ng mga elemento ng cytoskeleton ng mga selula ng halaman at hayop, ang mga tampok na katangian ng cytoskeleton ng mga selula ng tumor ay pinag-aralan. Gamit ang pamamaraang ito, natutunan nilang kilalanin ang sariling katangian ng mga kromosom ng tao, na kinakailangan sa pag-aaral ng pag-unlad ng mga pathology, pati na rin sa forensic na gamot. Ang paraan ng immunocytochemistry ay naging posible upang makilala ang mga indibidwal na marker sa ibabaw ng iba't ibang mga cell, na pinadali ang pag-unawa sa maraming mga proseso ng pathological, na naging posible upang malaman kung aling mga uri ng cell ang panimulang punto sa pag-unlad ng isang bilang ng mga sakit. Halimbawa, ipinakita ang papel ng mga macrophage at makinis na mga selula ng kalamnan ng mga daluyan ng dugo sa pagbuo ng atherosclerosis.

Mga tanong

1. Para saan ginagamit ang paraan ng immunocytochemistry?

2. Ano ang kakanyahan ng pamamaraan?

3. Ano ang alam mo tungkol sa fluorescent microscope?

mikroskopya ng elektron

Sa ikalawang kalahati ng XX siglo. Ang isang bagong paraan ng mikroskopya ay nagsimulang aktibong gamitin, na nagbibigay ng 100 beses na mas mataas na resolusyon ng mga biological na bagay kumpara sa light microscopy - electron microscopy.

Sa isang electron microscope, ang isang imahe ay binuo gamit ang isang makitid na sinag ng mga electron na dumadaan sa isang seksyon ng tissue sa mataas na bilis at nakikipag-ugnayan dito. Maaaring ma-absorb ang mga electron sa pamamagitan ng hiwa o ilihis mula sa orihinal na direksyon nito, na nagiging sanhi ng pagkalat ng makitid na electron beam. Ang mga makapangyarihang ring electromagnet ay ginagamit bilang mga device na bumubuo at tumutuon sa daloy ng elektron bago makipag-ugnayan sa seksyon ng tissue at pagkatapos nito. Ang boltahe sa column ng isang electron microscope ay umabot sa 100,000 volts. Ang imahe ay binuo sa isang luminescent screen, na kumikinang kapag nakikipag-ugnayan sa mga electron. Sa halip na ipakita ang isang bagay sa isang makinang na screen, ang imahe nito ay maaaring maayos sa isang photographic plate, na ginagawang posible na makakuha ng litrato. Upang pag-aralan ang mga biological na bagay, kinakailangan na bumuo ng mga bagong pamamaraan para sa paghahanda ng mga paghahanda.

Ang mga tissue ay naayos para sa electron microscopy na may glutaraldehyde, na "nag-crosslink" ng mga molekula ng protina, at bukod pa rito ay naayos na may osmium tetroxide, na nagpapatatag ng bilayer lipid membrane at nag-aayos din ng mga protina ng tissue. Upang makakuha ng mga seksyon, ang mga sample ng tissue ay pinapagbinhi ng mga polymer resin, na tumitigas upang bumuo ng isang hard plastic block. Ang mga napakanipis na seksyon na 50–100 nm ang kapal ay ginawa mula dito sa isang espesyal na ultramicrotome device na may salamin o brilyante na kutsilyo; 100–200 na seksyon ang maaaring ihanda mula sa isang cell. Pagkatapos ang mga seksyon ay pinapagbinhi ng mga asing-gamot ng mabibigat na metal (uranium, lead, phosphotungstic acid) upang madagdagan ang kaibahan ng imahe. Ang mga natapos na seksyon ay inilalagay sa isang manipis na grid ng tanso, ang mga cell nito ay natatakpan ng isang transparent na polymer film, at tiningnan sa ilalim ng isang electron microscope.

Bilang karagdagan sa mga seksyon, ang malalaking biological na molekula, ang istraktura ng mga lamad, mga globule ng protina, at ang ibabaw ng mga organel ng cell ay pinag-aaralan sa ilalim ng mikroskopyo ng elektron. Kapag pinag-aaralan ang ibabaw ng mga organelles o molekular complex, ang isang contrast na imahe ay nakakamit sa pamamagitan ng iba't ibang mga pamamaraan. Kadalasan ito ay nakakamit sa pamamagitan ng pag-spray ng manipis na layer ng ginto o platinum sa isang anggulo sa ibabaw ng bagay. Ang kapal ng gintong layer sa ibabaw ay tumutugma sa mga tampok na istruktura ng bagay. Ang ilang mga lugar ng bagay ay magkakaroon ng mas makapal na layer ng sputtering, sa ibang mga lugar ay walang sputtering dahil sa pagbuo ng isang shadow zone. Ang daloy ng elektron sa mikroskopyo ay nakadirekta patayo sa ibabaw ng bagay, na titiyakin ang pagtuklas ng liwanag at madilim na mga lugar sa ibabaw sa ilalim ng pag-aaral, dahil ang antas ng pagsipsip ng elektron ay magbabago depende sa kapal ng metal deposition layer.

Ang electron microscopy ay humantong sa makabuluhang pag-unlad sa pagbuo ng cytology. Ang pinong istraktura ng nucleus, lahat ng cytoplasmic organelles ay inilarawan: ang endoplasmic reticulum, ang Golgi apparatus, lahat ng uri ng vacuoles, mitochondria, plastids, centrioles (Fig. 5.1). Ito ay sa tulong ng electron microscopy na ipinakita na ang double-stranded DNA molecule na nakahiwalay sa bacteria ay may hugis ng singsing.

Ang electron microscopy, kung saan ang isang imahe ay binuo gamit ang isang stream ng mga electron na dumadaan sa isang bagay, ay tinatawag na transmission. Ang resolution nito para sa mga biological na bagay ay 2 nm sa ×100,000 magnification, na halos tumutugma sa diameter ng double helix ng DNA.

Bilang karagdagan sa transmission electron microscopy, mayroong scanning (scanning) electron microscopy, kapag ang isang imahe ay binuo gamit ang isang electron beam na makikita mula sa ibabaw ng bagay na pinag-aaralan. Ang ganitong mga mikroskopyo ng elektron ay tinatawag na pag-scan. Sa isang mikroskopyo, ang sample ay ini-scan ng isang makitid na sinag ng mga electron. Kapag ang sinag ng mga electron ay tumama sa sample, ang ibabaw ng sample, kung saan ang isang manipis na layer ng ginto ay idineposito, ay naglalabas ng "mga pangalawang electron". Ang mga ito ay nakarehistro sa pamamagitan ng aparato at na-convert sa isang imahe sa isang screen ng telebisyon. Ang maximum na resolution ng isang scanning microscope ay mas mababa kaysa sa isang transmission microscope at 10 nm para sa mga biological na bagay, at ang magnification ay ×20,000. Ang mga scanning microscope ay ginagamit upang pag-aralan ang mga panloob na ibabaw ng mga daluyan ng dugo, mga ibabaw ng cell at maliliit na istruktura. Ang scanning microscope ay nagbibigay ng isang three-dimensional na imahe.

Mga tanong

1. Anong mga uri ng electron microscope ang alam mo? Ano ang kanilang resolusyon?

2. Anong mga istruktura ang makikita sa nucleus at cytoplasm gamit ang transmission electron microscope?

3. Ano ang prinsipyo ng imaging sa isang electron microscope?

4. Ano ang mga tampok ng paghahanda ng mga paghahanda para sa electron microscopy?

Ang paraan ng autoradiography ay ginagamit upang malaman kung saang lugar sa cell nagaganap ang synthesis ng ilang polymeric molecules, upang pag-aralan kung saan inililipat ang mga synthesized substance. Kung hindi, ang pamamaraan ay tinatawag na radioautography. Maaari itong magamit para sa parehong light at electron microscopy. Ginagawang posible ng pamamaraan na makita ang mga biological polymer molecule na may label na radioactive isotopes sa isang cell. Ang nuclei ng radioactive isotopes ay hindi matatag, dumaranas ng pagkabulok, naglalabas ng mga sisingilin na particle o γ-ray. Itinatala ng eksperimento ang radioactive decay na ito sa photographic film.

Karaniwan, ang isang biopolymer monomer ay itinuturok sa dugo ng hayop, kung saan ang isa sa mga atomo ng hydrogen ay pinapalitan ng radioactive tritium. Halimbawa, ang nucleotide thymidine ay bahagi ng molekula ng DNA. Sa molekula ng thymidine, ang isa sa mga atomo ng hydrogen ay pinalitan ng tritium. Ang thymidine, na kumakalat kasama ng dugo, ay isasama sa mga selulang iyon kung saan kasalukuyang nagaganap ang pagtitiklop ng DNA. Sa mga stained tissue section, posibleng matukoy ang mga cell na nasa S-phase ng cell cycle. Upang gawin ito, ang isang maginoo na photographic emulsion ay inilapat sa isang may kulay na seksyon sa dilim, na, sa panahon ng pag-iimbak ng mga paghahanda, ay iluminado sa ilalim ng pagkilos ng enerhiya na ibinubuga ng isotopes. Matapos mabuo ang photoemulsion sa mga cell sa S-phase ng cell cycle, lumilitaw ang mga itim na butil ng pinababang pilak, na nabuo sa photoemulsion.

Ganyan noong 60s. ika-20 siglo ipinakita na ang pagtitiklop ng DNA ay posible sa komposisyon ng mga neuron sa utak, sa ilang mga departamento nito. Ngunit noong panahong iyon, mahirap isipin na ang mga stem cell na may kakayahang maghati ay naroroon sa utak ng mammalian. Pagkatapos ay iminungkahi na ang pagtitiklop ng DNA sa mga neuron ng utak ay nauugnay sa proseso ng memorya.

Ito ay ang paraan ng autoradiography na nagpakita na ang DNA ay palaging nasa nucleus at hindi napupunta kahit saan mula doon. Ang RNA, sa kabilang banda, ay synthesize sa nucleus at pagkatapos ay inilabas sa cytoplasm. Ang protina ay hindi kailanman na-synthesize sa nucleus. Ang site ng synthesis ng protina ay ang ribosomes ng cytoplasm. Mula dito, ang protina ay maaaring lumipat pareho sa nucleus at sa cytoplasmic organelles.

Sa konklusyon, dapat tandaan na ang bawat pamamaraan ay may sariling mga pakinabang at disadvantages. Ang mananaliksik ay dapat gumamit ng ilang mga pantulong na pamamaraan upang makamit ang isang pangwakas na konklusyon.

Mga tanong

2. Ano ang kakanyahan ng pamamaraan?

3. Ano ang mga resultang nakuha sa pamamaraang ito?

Fractionation ng mga cell

Mula noong kalagitnaan ng XX siglo. Napag-aralan ng mga cytologist hindi lamang ang buong mga cell, kundi pati na rin ang mga indibidwal na organelles na nakahiwalay sa mga cell sa isang mabubuhay na estado. Para dito, ginagamit ang isang cell fractionation method batay sa differential centrifugation.

Upang makakuha ng mga sample ng organoids, ang mga fragment ng tissue ay sinisira sa paraang mananatiling buo ang mga istruktura ng cellular. Para sa layuning ito, piliin angkop na kondisyon homogenization, i.e., pagkasira ng mga cell, isang angkop na daluyan para sa paghihiwalay ng mga istruktura ng cellular, isang buffer upang mapanatili ang isang tiyak na pH, sa panahon ng proseso ng paghihiwalay, ang isang mababang temperatura ay pinananatili, malapit sa zero. Bilang isang resulta, ang isang suspensyon ng mga cellular organelles ay nakuha, na naglalaman ng nuclei, mitochondria, lysosomes, ang Golgi apparatus, mga fragment ng endoplasmic reticulum, ribosomes at mga fragment ng mga lamad ng cell. Ang suspensyon ay sentripuged para sa mga espesyal na aparato- mga centrifuge. Iba't ibang organelles ang idineposito sa ilalim ng test tube kapag iba't ibang bilis sentripugasyon. Ang rate ng pag-aayos ay nakasalalay sa laki ng butil at density nito. Sa mababang bilis centrifugation ay ang unang namuo ng nuclei. Ang pagkakaroon ng natanggap na sediment ng nuclei, ang natitirang suspensyon ay ibinuhos sa isa pang test tube para sa susunod na yugto ng centrifugation. Ang sediment, na binubuo ng cell nuclei, ay hinahalo at ginagamit sa eksperimentong gawain. Ito ay paulit-ulit nang maraming beses, pinatataas ang bilis at tagal ng centrifugation. Ang pinakamataas na bilis ng centrifugation ay kinakailangan upang makagawa ng pinakamaliit na organelles, ang ribosome. Ang nuclei ay tumira sa ilalim ng tubo sa pamamagitan ng sentripugasyon sa loob ng dalawang minuto sa 2000 g. Ang mitochondrial pellet ay nakuha pagkatapos ng 30 minuto ng centrifugation sa 15,000 g, at ang mga ribosome ay nakolekta pagkatapos ng 3 oras ng centrifugation sa 40,000 g.

Gamit ang pamamaraang ito, sa unang pagkakataon sa mga cell, natuklasan ang mga lysosome - maliliit na vacuole na naglalaman ng hydrolytic enzymes at gumaganap ng mga digestive function sa mga cell. Matapos ang pagtuklas ng mga lysosome sa pamamagitan ng fractionation, natagpuan ang mga ito sa mga seksyon ng cell sa ilalim ng isang light at electron microscope gamit ang cytochemistry method, na nagpapakita ng gawain ng mga partikular na enzymes.

Ang posibilidad ng pagkuha ng mga purong fraction ng mga indibidwal na organelles ay naging posible na pag-aralan ang kanilang kemikal na komposisyon, isang hanay ng mga enzyme, at, sa huli, upang maunawaan kung paano gumagana ang isang partikular na istraktura ng cellular.

Mga tanong

1. Ano ang cell homogenization?

2. Bakit ang iba't ibang mga organelle ng cell ay hindi tumira sa ilalim nang sabay sa panahon ng centrifugation?

3. Anong mga cellular organelle ang natuklasan gamit ang paraan ng cell fractionation?

Paraan ng kultura ng cell

Karaniwan, ang mga laboratoryo na kasangkot sa pag-aaral ng cell biology ay may ilang mga pamamaraan sa kanilang arsenal. Ang paraan ng pag-kultura ng cell ay tiyak na isa sa kanila.

Sa simula ng XX siglo. natuklasan ng siyentipikong Pranses na si A. Carrel na sa ilalim ng mga kondisyong aseptiko ang mga selula ng isang multicellular na organismo ay maaaring lumaki sa isang artipisyal na nutrient medium sa mahabang panahon. Alam na ngayon na ang karamihan sa mga uri ng mga selula ng halaman at hayop sa ilalim ng kanais-nais na mga kondisyon ay hindi lamang nabubuhay at dumami sa labas ng katawan, kundi pati na rin sa pagkakaiba-iba, pagkuha. mahahalagang katangian mga espesyalisasyon. Halimbawa, ang mga selula ng kalamnan ng puso sa cell culture ay maaaring magkontrata.

Upang makakuha ng isang kultura ng cell, ang mga maliliit na piraso ng tissue ay nahahati sa mga indibidwal na mga cell gamit ang enzymatic at mekanikal na pagproseso, at isang cell suspension ay nakuha. Pagkatapos ang mga cell ay inilalagay sa mga espesyal na sisidlan na may patag na ilalim: salamin o plastik, at puno ng isang artipisyal na nutrient medium. Para sa bawat uri ng cell, ang kapaligiran ay indibidwal. Para sa karamihan ng mga selula ng hayop, ang nutrient medium ay naglalaman ng glucose, mahahalagang amino acid, bitamina, at isang maliit na porsyento ng serum ng dugo. Mahalagang mapanatili ang isang neutral na reaksyon ng kapaligiran, ang pinakamabuting kalagayan na temperatura, at upang maiwasan ang impeksiyon. Sa ilalim ng gayong mga kondisyon, ang mga selula ay tumira sa ilalim ng sisidlan ng kultura, nakakabit sa baso, kumalat dito, nakuha ang kanilang katangian na hugis, at nagsimulang hatiin. Pagkatapos ng ilang araw, ang buong ibabaw ng ilalim ng sisidlan ay napupuno ng mga selula. Dumating ang isang sandali ng pagsugpo sa pakikipag-ugnay, ang mga selula ay huminto sa paghahati. Ang mga normal na selula ay maaaring manatiling mabubuhay sa dormant na estado na ito sa loob ng ilang panahon. Para sa karagdagang paglilinang, sila ay kinokolekta mula sa unang sisidlan at inilipat sa ilang iba pang mga sisidlan sa ilalim ng parehong mga kondisyon. Ang cycle ay paulit-ulit na muli. Ito ay kung paano nakukuha ang mga transplantable cell culture.

Ito ay sa tulong ng pamamaraan ng kultura ng cell na unang inilarawan ang mga katangian ng mga selula ng tumor. Ang unang tampok ay ang kakayahang walang katapusan na paghahati. Noong 50s. ika-20 siglo nakuha ang isang transplantable cell culture ng mga selula ng kanser sa suso. Ang kultura ay pinangalanang HeLa pagkatapos ng mga unang titik ng pangalan ng inoperahang pasyente. Buhay pa rin ang mga selulang ito, at maraming laboratoryo sa buong mundo ang nagtatrabaho sa kanila. Sa paglipas ng mga taon, pinalaki ng mga siyentipiko ang tonelada ng mga selulang ito, bagaman ang pasyente mismo ay matagal nang nawala.

Ang isa pang tampok ng mga selula ng kanser ay hindi sila tumitigil sa paghahati, na pinupuno ang buong ibabaw ng sisidlan. Ang mga cell ay gumagapang sa ibabaw ng bawat isa, maaaring bumuo ng pangalawa at pangatlong layer.

Ang mga hindi nabagong normal na selula ay maaaring hatiin limitadong dami minsan. Ang ganitong kultura ay hindi maaaring mapanatili nang walang katiyakan. Pagkatapos ng ilang mga sipi, ang mga selula ay hihinto sa paghahati at mamatay.

Ang pagtatrabaho sa mga kultura ng cell ay nagbibigay ng magagandang pagkakataon para sa mga mananaliksik. Sa mga unang yugto ng pag-unlad ng cytology, ang mga kultura ng cell ay ginamit para sa visual na pagmamasid ng mga buhay na selula. Ang mga proseso ng mitosis, paggalaw ng cell, at ang pagbuo ng mga contact sa pagitan ng mga cell ay pinag-aralan. Ngayon ang mga kultura ng cell ay ginagamit upang pag-aralan ang mga proseso ng pagkita ng kaibhan, upang makakuha ng mga transplantable cell line ng mga embryonic stem cell. Ginagamit ang mga cell culture para magmodelo ng iba't ibang pathological na kondisyon: ischemia, chemical o hormonal stress, para maglipat ng foreign genetic information, atbp. Ang mga cell culture ay malawak. praktikal na gamit upang makakuha ng mga tiyak na antibodies, enzymes, mga kadahilanan na kumokontrol sa mahahalagang aktibidad ng mga selula, ginagamit ang mga ito sa pagbuo ng mga bakuna.

Ang buong mga organismo ay maaaring lumaki mula sa mga kultura ng cell ng halaman, kaya ginagamit ang mga ito upang lumikha ng mga bagong uri ng halaman na may mga katangian na mahalaga para sa mga tao.

Mga tanong

1. Paano nakukuha ang tuluy-tuloy na mga kultura ng cell?

2. Anong mga katangian ng mga selula ng kanser ang napag-aralan sa kultura ng selula?

3. Para saan ginagamit ang mga cell culture?

Confocal microscopy

Ang malawak na interes sa confocal microscopy ay lumitaw sa pagtatapos ng ika-20 siglo. salamat sa mabilis na pag-unlad ng mga teknolohiya ng computer at laser. Ang confocal microscope ay isang optoelectronic na instrumento. Ito ay batay sa isang fluorescent microscope, kung saan ang bagay ay iluminado ng isang laser beam at ang resultang imahe ay pinoproseso gamit ang memorya ng computer. Dahil sa diskarteng ito, posible na muling likhain ang isang three-dimensional na imahe ng isang bagay kapag sinusuri ang isang serye ng mga optical na seksyon. Ang imahe ay nilikha sa isang screen ng computer. Ang resolution ng mikroskopyo ay nadagdagan kumpara sa maginoo fluorescent mikroskopyo mga 1.5 beses. Ang pangunahing bentahe ng isang confocal microscope ay hindi isang pagtaas sa resolution, ngunit isang makabuluhang pagtaas sa contrast ng imahe.

Ang confocal microscope ay nagbibigay ng dalawang napakahalagang pagkakataon: pinapayagan ka nitong suriin ang mga tisyu sa antas ng cellular sa isang estado ng pisyolohikal na sigla, pati na rin suriin ang mga resulta ng pananaliksik sa apat na sukat: taas, lapad, lalim at oras.

Ginagamit ng mikroskopyo na ito ang mga prinsipyo ng fluorescent microscopy at immunocytochemistry gamit ang mga espesyal na fluorochromes para sa confocal microscope. Bilang karagdagan sa fluorescence confocal na imahe, ang isang kaukulang imahe ng sample sa transmitted light ay maaaring makuha sa mikroskopyo.

Ang paggamit ng isang confocal microscope ay ginagawang posible upang mai-localize ang mga indibidwal na gene sa istraktura ng interphase nucleus; pag-aralan ang dalawa o higit pang mga protina na may label na magkakaibang mga antibodies sa parehong oras upang maunawaan kung mayroong isang functional na relasyon sa pagitan ng mga ito; upang pag-aralan ang mga dinamikong proseso sa cell, kabilang ang transportasyon ng mga sangkap sa pamamagitan ng mga lamad.

Sa pamamagitan ng paggamit ng mga pang-agham at teknolohikal na tagumpay ng XX at XXI na siglo. sa cytology, ang mga bagong pamamaraan ay binuo na naging posible upang lumipat sa isang bagong antas ng molekular ng pananaliksik na may posibilidad na pag-aralan hindi lamang ang mga istruktura ng cell, kundi pati na rin ang mga molekula na nagsasagawa ng iba't ibang mga pag-andar.

Mga tanong

1. Ilarawan ang prinsipyo ng confocal microscope.

2. Ano ang resolusyon nito?

3. Ano ang gamit ng confocal microscope?

1) Ano ang cytology? Paksa at mga gawain ng cytology. Ano ang papel ng cytology sa sistema ng biological na kaalaman at para sa modernong gamot? Ang papel ng mga domestic scientist sa pagbuo ng modernong cytology.

Cytology (Greek kytos - cell, cell) ay ang agham ng cell.

Ang paksa ng pag-aaral nito ay ang cell bilang isang istruktura at functional na yunit ng buhay. Kasama sa mga gawain ng cytology ang pag-aaral ng istraktura at paggana ng mga cell, ang kanilang kemikal na komposisyon, ang mga pag-andar ng mga indibidwal na sangkap ng cellular, ang kaalaman sa mga proseso ng pagpaparami

mga cell, pagbagay sa mga kondisyon sa kapaligiran, ang pag-aaral ng mga tampok na istruktura ng mga dalubhasang selula, ang mga yugto ng pagbuo ng kanilang mga espesyal na pag-andar, ang pagbuo ng mga tiyak na istruktura ng cellular, atbp. Iba't ibang mga pamamaraan ang ginagamit upang malutas ang mga problemang ito sa cytology.

Malaki rin ang kontribusyon ni R. Virchow sa pamamagitan ng pagbuo at pagdagdag sa teorya ng cellular; isinulat niya ang akdang "Cellular Pathology"

Ang unang departamento ng histolohiya ay binuksan sa Moscow University noong 1864 ni Propesor Ovsyannikov. Kasabay nito, binuksan ang departamento sa Military Medical Academy, na pinamumunuan ni Lavdovsky. Pagkalipas lamang ng 13 taon, ang unang aklat-aralin nina Ovsyannikov at Lavdovsky ay lumitaw sa Russia. Ang Moscow Department of Histology ay pinamumunuan ni A.I. Babukhin.

R e p e s s i n g o f e th e th e of th e s h o o l s h o o u s s o u t i o n t h e r e c o n d e r c o n i th histophysiological position, i.e. hindi lamang inilarawan ang istraktura, ngunit sinubukang ipaliwanag

regularidad ng istraktura, samakatuwid, ang physiological orientation ay isang priyoridad para sa domestic histology.

Ang Kazan school of morphologists ay kilala sa mga gawa nito sa larangan ng pag-aaral ng nervous tissue, kabilang ang nangungunang mananaliksik. Si Arnstein, Smirnov at Dogel ang naging tagapagtatag ng kalakaran na ito. Samakatuwid, sa Russia, maraming mga katanungan tungkol sa istraktura ng mga organo at tisyu ang nagsimulang isaalang-alang mula sa posisyon regulasyon ng nerbiyos. Ito ay pinadali din ng gawain ni Botkin, Pavlov at Sechenov.

Sa simula ng ika-20 siglo, ang mga diskarte sa ebolusyon batay sa gawain nina Darwin at Haeckel ay nagsimulang umunlad nang mas masinsinan sa histolohiya. Salamat sa gawain ng mga embryologist na sina Wolf, Pander at Baer, ​​​​at kalaunan sa gawain nina Mechnikov at Kovalevsky, ipinagpatuloy ang pananaliksik sa larangan ng embryology at suportado ang mga diskarte sa ebolusyon.

Ang direksyon ng paaralang histological ng Sobyet ay malinaw na may kaugnayan sa klinika, kaya ang karamihan sa gawaing histological ay naglalayong lutasin ang mga klinikal na problema.

2) Mga pamamaraan ng pananaliksik sa cytology. Mga pamamaraan para sa paghahanda ng mga paghahanda para sa light microscopy. Kahalagahan at pamamaraan ng paglamlam ng mga micropreparations. Teknik ng mikroskopya.

Ang pangunahing paraan para sa pag-aaral ng mga cell ay light microscopy. Ang mata ng tao ay may resolusyon na humigit-kumulang 100 µm (1 µm = 0.001 mm). Nangangahulugan ito na lumilitaw bilang isang malabong tuldok ang dalawang tuldok na mas mababa sa 100 µm ang pagitan. Upang makilala ang mas maliliit na istruktura, ginagamit ang mga optical na instrumento, sa partikular na mga mikroskopyo. Ang kapangyarihan ng paglutas ng mga mikroskopyo ay 0.13-0.20 microns, iyon ay, halos isang libong beses na mas mataas kaysa sa kapangyarihan ng paglutas ng mata ng tao. Sa tulong ng mga light microscope, na gumagamit ng sikat ng araw o artipisyal na liwanag, posible na ipakita ang maraming mga detalye ng panloob na istraktura ng cell - indibidwal.

organelles, cell wall. Imposibleng gumawa ng high-resolution na light microscope dahil ang resolution ay nauugnay sa wavelength ng light rays, at hindi lang sa kalidad ng magnifying glass.

Upang pag-aralan ang ultrafine na istraktura ng mga istruktura ng cellular, ginagamit ang paraan ng electron microscopy. Ang mga electron microscope ay gumagamit ng isang sinag ng mga electron sa halip na mga light beam. Ang resolution ng modernong electron microscopes ay 0.1 nm, kaya napakahusay na mga detalye ay ipinahayag sa kanilang tulong. Nakikita sa isang electron microscope

biological lamad (kapal 6-10 nm), ribosomes (diameter tungkol sa 20 nm), microtubule (kapal tungkol sa 25 nm) at iba pang mga istraktura.

Upang pag-aralan ang komposisyon ng kemikal, upang matukoy ang lokalisasyon ng mga indibidwal na kemikal sa cell, ang mga pamamaraan ng cyto- at histochemistry batay sa pumipili na pagkilos ng mga reagents at mga tina sa ilang mga kemikal ng cytoplasm ay malawakang ginagamit. Ang paraan ng differential (separation) centrifugation ay nagbibigay-daan sa paggamit ng centrifuge upang paghiwalayin ang mga nilalaman ng cell sa magkakahiwalay na bahagi ng iba't ibang masa at pagkatapos ay pag-aralan ang kanilang kemikal na komposisyon nang detalyado. Ang paraan ng pagsusuri ng X-ray diffraction ay ginagawang posible upang matukoy ang spatial na pag-aayos at pisikal na katangian ng mga molekula (halimbawa, DNA, mga protina) na bumubuo sa mga istruktura ng cellular.

Upang matukoy ang lokalisasyon ng mga site ng synthesis ng biopolymers, upang matukoy ang mga paraan ng paglipat ng mga sangkap sa cell, ang paraan ng autoradiography ay malawakang ginagamit - ang pagpaparehistro ng mga sangkap na may label na radioactive isotopes. Maraming mga proseso ng cell vital activity, sa partikular na cell division, ay naitala gamit ang film at photography.

Ang pag-aaral ng mga selula ng iba't ibang organo at tisyu ng mga halaman at hayop, ang mga proseso ng paghahati ng selula, ang kanilang pagkita ng kaibhan at pagdadalubhasa ay isinasagawa sa pamamagitan ng pamamaraan ng mga kultura ng selula - ang paglilinang ng mga selula (at buong organismo mula sa mga indibidwal na selula) sa nutrient media sa ilalim sterile na kondisyon.

Sa pag-aaral ng mga buhay na selula, ang pagpapaliwanag ng mga pag-andar ng mga indibidwal na organelles, ang mga pamamaraan ng microsurgery ay ginagamit - isang epekto sa pagpapatakbo sa cell na nauugnay sa pag-alis o pagtatanim ng mga indibidwal na organelles, ang kanilang paglipat mula sa cell patungo sa cell, pagpapakilala sa

isang cell ng malalaking macromolecules, atbp.

Vital staining method Para sa vital (lifetime) na pagtitina, 0.2-0.001% aqueous solution ang ginagamit.

methylene at toluoidine blue, neutral na bibig at Congo red, na idinagdag sa isang pinindot o nakabitin na patak ng kultura. Ang pamamaraang ito ay nagpapakita ng spirochetes, protozoa, tinutukoy ang kadaliang mapakilos ng bakterya, ang immune swelling ng kapsula, ngunit ang paggamit nito ay nangangailangan ng mahigpit na pagsunod sa mga patakaran na hindi kasama ang impeksyon sa laboratoryo.

Mga pamamaraan ng paglamlam ng post-vital Ang mga pamamaraan para sa paglamlam ng mga nakapirming paghahanda (post-vital) ay nahahati sa simple at

kumplikado. Sa mga simpleng pamamaraan, ang mga solusyon sa paglamlam ng Pfeiffer fuchsin (pagkakalantad 1-2 minuto), alkaline methylene blue (3-5 minuto) ay inilalapat sa isang nakapirming paghahanda upang ganap itong masakop ang pahid, ang tina ay pinatuyo, ang paghahanda ay hugasan ng isang stream ng tubig, inalog, tuyo at mikroskopyo .

Ang mga simpleng pamamaraan ay ginagawang posible upang hatulan ang laki, hugis, lokalisasyon, at magkaparehong pag-aayos ng mga indibidwal na selula, ngunit hindi sila magagamit upang maitatag ang istruktura ng mga mikrobyo at kadalasan ang kanilang pagkakaiba-iba na kaugnayan sa mga tina.

Sa mga kumplikadong pamamaraan ng paglamlam ng bakterya, pangunahing ginagamit nila ang magkakaibang pamamaraan ng Gram, ang pagtuklas ng resistensya ng acid ayon kay Ziehl-Nelson, ang pagpapasiya ng mga butil ng volutin ayon kay Leffler o Neisser, ang paraan ng pagkakaiba-iba ng Romanovsky-Giemsa, ang negatibong positibo. paraan para sa pagtukoy ng kapsula ayon sa Gins-Burri, ang pagtuklas ng mga spores ayon kay Peshkov o Ziehl - Nelson at iba pa.

Para sa paglamlam ng protozoa, ginagamit ang paraan ng Romanovsky-Giemsa at paglamlam ng hematoxylin-eosin.

Ang mga kabute ay sinusuri na hindi nabahiran o sa pamamagitan ng mga pamamaraan ng Gram, Ziel - Nelson, Leffler, Romanovsky - Giemsa, pati na rin ang solusyon ng Lugol, lactofuchsin, atbp.

Teknik ng mikroskopya. Bago ka magsimula ng mikroskopya, kailangan mong itakda ang tamang pag-iilaw. Upang gawin ito, alisin ang eyepiece mula sa mikroskopyo at, tumingin nang direkta sa lens, itakda ang salamin upang ang ilaw na pinagmulan (lampara o bintana) ay makikita sa gitna ng lens. Pagkatapos i-pre-set ang ilaw sa entablado ng mikroskopyo, ilagay tapos na produkto at i-secure ito gamit ang mga clip. Gamit ang isang macrometric turnilyo, ang tubo ay ibinababa halos upang makipag-ugnayan sa coverslip. Pagkatapos, tumingin sa eyepiece, unti-unting itaas ang tubo hanggang lumitaw ang imahe. Para sa paggamit ng hasa

micrometer screw.

Kapag mikroskopya, panatilihing bukas ang parehong mga mata. Tumingin sa mikroskopyo gamit ang kaliwang mata.

3) Ang istraktura at pag-andar ng cell nucleus ayon sa light at electron microscopy. Ang hugis at bilang ng nuclei. Ang mga pangunahing bahagi ng kernel. Pakikipag-ugnayan ng mga istruktura ng cell sa proseso ng metabolismo (halimbawa, ang pagbuo ng enamel at dentin ng ngipin).

Ang nucleus ay naroroon sa mga selula ng lahat ng eukaryotes maliban sa mga mammalian erythrocytes. Ang ilang protozoa ay may dalawang nuclei, ngunit bilang panuntunan, ang cell ay naglalaman lamang ng isang nucleus. Ang nucleus ay tinatanggal mula sa cytoplasm ng nuclear membrane, na binubuo ng dalawang lamad: panlabas at panloob, na may parehong istraktura ng plasma membrane. Sa pagitan ng mga ito ay isang makitid na espasyo na puno ng isang semi-likidong sangkap. Sa pamamagitan ng maraming mga pores sa nuclear envelope, ang pagpapalitan ng mga sangkap sa pagitan ng nucleus at cytoplasm ay nagaganap (sa partikular, ang paglabas ng mRNA sa cytoplasm). Ang panlabas na lamad ay madalas na natatakpan ng mga ribosom na nagsi-synthesize ng protina.

Sa ilalim ng nuclear envelope ay ang karyoplasm (nuclear juice), na tumatanggap ng mga sangkap mula sa cytoplasm. Ang karyoplasm ay naglalaman ng chromatin, ang sangkap na nagdadala ng DNA, at nucleoli. Ang nucleolus ay isang bilugan na istraktura sa loob ng nucleus kung saan nabuo ang mga ribosom. Ang kabuuan ng mga chromosome na nakapaloob sa chromatin ay tinatawag na chromosome set. Ang bilang ng mga chromosome sa mga somatic cells ay diploid (2n), kabaligtaran sa mga germ cell na mayroong haploid set ng mga chromosome (n).

Ang pinakamahalagang pag-andar ng nucleus ay ang pangangalaga ng genetic na impormasyon. Kapag naghahati

ang cell nucleus ay nahahati din sa dalawa, at ang DNA sa loob nito ay kinopya (kinokopya). Dahil dito, ang lahat ng mga cell ng anak na babae ay mayroon ding nuclei.

Ang mga bagong odontoblast ay nabuo mula sa mga selulang parenchymal ng pulp sa buong buhay ng isang tao. Ang proseso ng pagkita ng kaibhan ay nangyayari sa ilalim ng kontrol ng mga regulatory protein. Metabolismo ng dentine, i.e. matrix building, mineralization, remodeling, ay magkapareho sa bone tissue, ngunit ang mga prosesong ito ay nagpapatuloy nang mas mabagal. Kakaiba si Dentin tissue ng buto dami at husay na komposisyon ng protina, pati na rin ang nilalaman ng sangkap ng mineral. Iba rin ang aktibidad ng ilang metabolic process.

AT ang pagpapalitan ng mga organikong sangkap ay nagsasangkot ng mga odontoblast na nakahiga sa hangganan ng dentin at pulp. Kapag nasira ang dentin, ang mga cell na ito ay nakapagpapanumbalik ng matrix at na-regulate ang mineralization nito. Sa dentistry, ginagamit ang mga gamot na nagpapasigla sa prosesong ito.

AT sa proseso ng pagbuo ng matrix at mineralization nito (pagkahinog ng enamel), nangyayari ang isang pagbabago organikong komposisyon tissue at ameloblast apoptosis. Ang mature na enamel ay isang cell-free mineralized tissue at samakatuwid ay hindi na muling makabuo kapag nasira.

AT ang komposisyon ng organikong bahagi ng mature enamel ay may kasamang ilang mga enzyme: serine protease, metalloproteases (collagenases), phosphatases, na lumahok sa pagkasira ng mga protina sa yugto ng mineralization at bahagyang napanatili sa matrix. Bilang karagdagan, mayroong mga libreng amino acid (glycine, valine, proline, hydroxyproline), mga bakas ng glycosylated, sulfated, phosphorylated proteins, katulad ng mga non-collagen bone protein. Ang pagsusuri sa mga istrukturang naglalaman ng carbohydrate ng glycoproteins ay nagpakita ng pagkakaroon ng galactose, glucose, mannose, glucuronic acid at mga bakas ng iba pang monosaccharides. Ang enamel ay naglalaman ng napakaliit na halaga ng citrate at lipid. organikong bagay na matatagpuan sa pagitan ng apatite crystals sa anyo ng mga bundle, plates o spindles, nakakaapekto ang mga ito sa biochemical at pisikal na proseso na nagaganap sa enamel ng ngipin.

4) Mga organel. Kahulugan, pag-uuri, istraktura at mga pag-andar. Mga organel pangkalahatang kahulugan. Mga organel espesyal na kahulugan. Istraktura at pag-andar ayon sa light at electron microscopy

Ang mga organel ay nahahati sa dalawang grupo: may lamad at hindi lamad. Ang mga organelle ng lamad ay ipinakita sa dalawang variant: dalawang-lamad at isang lamad.

Ang dalawang-membrane na bahagi ay plastids, mitochondria, at ang cell nucleus.

Upang Kasama sa single-membrane ang mga organelles ng vacuolar system - endoplasmic reticulum, Golgi complex, lysosomes, vacuoles ng halaman at fungal cells, pulsating vacuoles, atbp.

Kabilang sa mga non-membrane organelles ang ribosomes at ang cell center, na patuloy na naroroon sa cell.

5) Mga pagsasama. Kahulugan, pag-uuri, papel sa buhay. mga selula.

Ang mga pagsasama ng cytoplasm ay mga opsyonal na bahagi ng cell na lumilitaw at nawawala depende sa intensity at likas na katangian ng metabolismo sa cell at sa mga kondisyon ng pagkakaroon ng organismo. Ang mga pagsasama ay may anyo ng mga butil, bukol, patak, vacuoles, mga butil ng iba't ibang laki at hugis. Ang kanilang kemikal na kalikasan ay lubhang magkakaibang. Depende sa functional na layunin pinagsama-sama ang mga inklusyon:

tropiko;

mga lihim;

mga hormone;

mga pigment;

mga dumi, atbp.

mga espesyal na pagsasama ( hemoglobin)

Kabilang sa mga trophic inclusions (reserve sustansya) Ang taba at carbohydrates ay may mahalagang papel. Ang mga protina bilang trophic inclusions ay ginagamit lamang sa mga bihirang kaso(sa

mga selula ng itlog sa anyo ng mga butil ng yolk).

Ang mga pigmented inclusion ay nagbibigay sa mga cell at tissue ng isang tiyak na kulay.

Ang mga lihim at hormone ay naipon sa mga glandular na selula, dahil ang mga ito ay mga partikular na produkto ng kanilang functional na aktibidad.

Ang mga excretions ay ang mga end product ng mahahalagang aktibidad ng cell na aalisin dito.

6. Mga tampok ng istraktura at pag-andar ng cell membrane ayon sa light at electron microscopy. Mga derivatives ng cell lamad. Mga intercellular na koneksyon at ang kanilang istruktura at functional na mga katangian.

Ang hadlang na nagpoprotekta sa mga cell ay tinatawag nating cell membrane. Hindi nito pinapayagan ang mga bahagi ng cell (cytoplasm) na tumagas. Ang pangunahing gawain ng cell membrane ay panatilihing buo ang cell, habang tinutukoy kung ano ang maaaring makuha sa loob ng cell at kung ano ang maaaring lumabas. Ang mga selula ng anumang organismo ay may mga lamad ng selula, maging ang mga selulang bacterial.

Ang cell lamad ay binubuo ng isang binary na serye ng mga lipid. Ang mga molekula ng lipid ay nakaayos sa dalawang hanay at ang bawat hilera ay eksaktong kapareho ng nauna. Ang istraktura ng molekula ng lipid - ang dalawang bahagi ng isang solong kabuuan, ay ipinapakita lamang. Ang dalawang bahaging ito ng isang buo ay tinatawag ding hydrophobic (hindi tinatagusan ng tubig) at hydrophilic na mga seksyon.

Ang hydrophobic na seksyon ay hindi gusto ng tubig at mga molekulang tulad ng tubig, salamat sa binary layer ng mga lipid na ito ay gumaganap bilang isang uri ng mekanismo ng pagtatanggol.

Ang hydrophilic section, sa kabilang banda, ay nakakaakit ng tubig at mga molekulang tulad ng tubig, at pagkatapos ay itinutulak ang mga ito palabas. Ang resulta ay tulad ng isang pangunahing modelo ng liquid mosaic.

shell derivatives: cytoplasm na may ribosomes at iba't ibang mga inklusyon, nucleoid;

pansamantalang - kapsula, mauhog lamad, flagella, villi, endospores, na nabuo lamang sa ilang mga yugto ng siklo ng buhay ng bakterya, sa ilang mga species sila ay ganap na wala.

Intercellular contact - mga koneksyon sa pagitan ng mga cell na nabuo sa tulong ng mga protina. Ang mga intercellular contact ay nagbibigay ng direktang komunikasyon sa pagitan ng mga cell. Bilang karagdagan, ang mga cell ay nakikipag-usap sa isa't isa sa malayo gamit ang mga signal (pangunahin -

signaling substances) na ipinadala sa pamamagitan ng intercellular substance.

Ang istraktura ng mga intercellular na koneksyon Sa mga tisyu kung saan ang mga cell o ang kanilang mga proseso ay mahigpit na katabi ng bawat isa (epithelium,

tissue ng kalamnan, atbp.) Ang mga koneksyon ay nabuo sa pagitan ng mga lamad ng pakikipag-ugnay sa mga cell - mga intercellular contact. Ang bawat uri ng intercellular contact ay nabuo sa pamamagitan ng mga tiyak na protina, ang karamihan sa mga ito ay mga transmembrane protein. Maaaring ikonekta ng mga espesyal na protina ng adapter ang mga protina ng intercellular contact sa cytoskeleton, at ang mga espesyal na "skeletal" na protina ay maaaring magkonekta ng mga indibidwal na molekula ng mga protina na ito sa isang kumplikadong supramolecular na istraktura. Sa maraming mga kaso, ang mga intercellular na koneksyon ay nasisira kapag ang mga Ca2+ ions ay tinanggal mula sa medium.

Mga pag-andar ng mga intercellular junction Ang mga intercellular junction ay nangyayari sa mga punto ng pakikipag-ugnay ng mga cell sa mga tisyu at nagsisilbi sa

intercellular transport ng mga substance at signal transmission (intercellular interaction), pati na rin para sa mechanical fastening ng mga cell sa isa't isa.

Maaaring maipadala ang mga de-koryenteng signal sa pamamagitan ng mga gap junction. Ang mga selula ng mga organo at tisyu ay gumagawa ng ilang kemikal na kumikilos sa ibang mga selula (kabilang ang sa pamamagitan ng mga intercellular contact) at nagdudulot ng pagbabago sa gawain ng cytoskeleton, sa intensity ng metabolismo at sa proseso ng synthesis ng protina ng cell.

7) Mitotic cycle. Mga katangian ng lahat ng mga yugto ng mitosis. Meiosis, mga tampok nito, mga pagkakaiba sa mitosis. Ang pagbabagong-buhay at reaktibiti ng mga selula at ang kanilang mga pagpapakita sa mga organo ng oral cavity.

Ang mitotic cycle ay ang buhay ng isang cell mula sa paghahati hanggang sa susunod na dibisyon. Ang mitotic cycle sa mahinang pagkakaiba-iba ng mga populasyon ng cell ay tumatagal ng halos isang araw. Ang siklo ng buhay ay maaaring katumbas ng mitotic, ngunit sa kaibahan nito, ito ay isang mas malawak na konsepto at sumasaklaw sa mga postmitotic na populasyon ng mga cell na nawalan ng kakayahang hatiin na may mataas na antas ng pagkita ng kaibhan.

Kung ang cell ay nahahati at ang mitotic at cell cycle ay pantay, kung gayon ang cycle ay nangangahulugan ng paulit-ulit na pag-uulit ng isang tiyak na pagkakasunud-sunod ng mga kaganapan, na ang pangwakas ay nakumpleto sa simula ng unang susunod na pagkakasunud-sunod. Ang mitotic cycle ay nagtatapos sa telophase na may cell division, at ang isang bago ay nagsisimula sa pagbuo ng dalawang bagong cell. Ang mitotic cycle ay binubuo ng mitosis at interphase. Sa interphase, ang mga sunud-sunod na phase G1, S at G2 ay nakikilala.

Ang G1 phase (presynthetic period) ay kadalasang pinakamahaba at sumusunod sa telophase ng mitosis. Ito ay tumatagal mula 10 oras hanggang ilang araw: sa mabilis na paghahati ng mga selula, ito ay mas maikli. Sa panahon ng G1-phase, ang paghahanda para sa pagdodoble ng chromosome ay nagaganap, ang cell ay masinsinang nag-synthesize ng RNA at mga protina, lumalaki, at ang bilang ng mga ribosome at mitochondria ay tumataas. Ibinabalik ng cell ang laki ng hinalinhan nito. Ang pagkakaroon ng maabot ang isang tiyak na laki, ang cell ay pumapasok sa susunod na yugto (synthetic period), ngunit hindi ito palaging nangyayari. Ang ilang mga cell ay patuloy na nag-iipon ng mga elemento ng istruktura at hindi nahahati. Pagkatapos ay ang G1-phase ay naantala, at ang mga cell ay maaaring huminto sa paghahati, na pumasa sa tinatawag na G0-phase.

Maaaring nasa G0 phase ang mga cell matagal na panahon, magsimulang lumaki, magkaiba, maabot ang estado ng terminal (panghuling) pagkita ng kaibhan. Ang ganitong cell ay kadalasang nawawalan ng kakayahang hatiin, at sa kasong ito, ang pagtatapos ng panahon ng cell ay sinamahan ng pagkamatay ng cell.

Sa S-phase ng interphase (synthetic period), ang synthesis ng protina ay nagpapatuloy sa cell, ngunit ang prosesong ito ay hindi ang pangunahing. Ang nangungunang proseso ay ang pagtitiklop ng DNA (pagdodoble), na nangyayari nang sabay-sabay sa maraming mga punto ng DNA (mga replika). Nagsisimula na rin ang pagdodoble

centrioles sa cell center. Sa karamihan ng mga cell, ang synthetic period ay tumatagal ng 8-12 oras. Sa pagtatapos ng synthetic period, ang cell ay may tetraploid set ng DNA at isang double set ng centrioles.

Sa yugto ng G2 ng interphase (postsynthetic period), bumababa ang synthesis ng RNA, nagpapatuloy ang natitirang synthesis ng protina, at naipon ang enerhiya para sa mitosis. Sa panahong ito, ang mga protina na kinakailangan para sa normal na paghahati ng cell ay na-synthesize, kabilang ang mga tubulin - mga microtubule na protina. Ang cell ay naglalaman ng isang tetraploid set ng DNA. Ang mga sentrioles ng anak na babae ay tumataas

laki at maabot ang laki ng mga mature organelles. Ang yugtong ito ay tumatagal ng 2-4 na oras.

Ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng mitosis at meiosis ay:

1) sa mitosis, ang bawat cycle ng nuclear division ay nauugnay sa isang pagpaparami ng mga chromosome; sa meiosis, dalawang dibisyon ang nauugnay sa isang reproduction;

2) sa mitosis, ang bawat chromosome ay muling ginawa, at sa anaphase, ang mga anak na chromosome ay naghihiwalay patungo sa mga pole. Sa kasong ito, ang mga homologous chromosome ay kumikilos nang nakapag-iisa. Bilang resulta ng paghahati, ang bawat cell ng anak na babae ay tumatanggap ng isang kumpletong hanay ng mga chromosome na may parehong nilalaman ng gene. Sa meiosis, sa prophase, ang bawat pares ng homologous chromosomes conjugates, at sa anak na babae nuclei mayroong isang pagbawas sa bilang ng mga chromosome nang eksakto sa kalahati, na tumutugma sa bilang ng mga bivalents. Sa kasong ito, ang bawat pares ng mga homologue ay nag-iisa nang malaya sa iba pang mga pares. Sa mga kaso kung saan, para sa iba't ibang mga kadahilanan, ang isa sa mga homologue ng homologous chromosome ay nawala, ang mga solong chromosome na walang homologue (univalents) ay random na naghihiwalay at nahuhulog sa isa lamang sa nuclei ng anak na babae;

3) dahil sa kawalan ng chromosome conjugation sa mitosis at ang presensya nito sa meiosis, isang mahaba at kumplikadong prophase ang nagaganap sa huli.

Ang Meiosis, kasama ang mga yugto at yugto ng pag-unlad ng selula ng mikrobyo, ay isa lamang sa mga yugto sa proseso ng sekswal na pagpaparami; pagkatapos ng meiosis, ang yugto ng pagbuo ng mga mature na selula ng mikrobyo - nagsisimula ang gametes. Ang proseso ng pagbuo ng mga mature na selula ng mikrobyo ay tinatawag na gametogenesis.

walo). Ang cell ay ang pangunahing yunit ng buhay. Cell cycle (ilarawan ang mga yugto ng cell cycle). Mga pangunahing probisyon teorya ng cell at ang mga implikasyon nito sa gamot

Ang cell ay ang pinakamaliit na estruktural at functional unit ng mga buhay na organismo, na may kakayahang mag-renew ng sarili, self-regulation at self-reproduction.

Ang isang cell ay isang espesyal na sistema ng mga biopolymer, na nililimitahan ng isang cell membrane na may selective permeability.

Ang isang cell ay ang pinakamaliit na istraktura na mayroong lahat ng mga pangunahing katangian ng isang buhay na bagay. Ang mga bahagi at organel nito ay hindi kayang isa-isang gampanan ang lahat ng mga pag-andar at, sa gayon, ay hindi maituturing na hiwalay (nagsasarili) na mga yunit ng pamumuhay.

Ang eukaryotic cell cycle ay binubuo ng dalawang panahon:

Isang panahon ng paglaki ng cell na tinatawag na "interphase" kung saan ang DNA ay synthesize

at protina at paghahanda para sa paghahati ng cell.

panahon paghahati ng selula, na tinatawag na "phase M" (mula sa salitang mitosis - mitosis). Ang interphase ay binubuo ng ilang mga panahon:

G1-phase (mula sa English gap - gap), o ang yugto ng paunang paglaki, kung saan ang mRNA, mga protina, at iba pang bahagi ng cellular ay synthesize;

S-phase (mula sa English synthesis - synthesis), kung saan ang DNA ng cell nucleus ay ginagaya, ang mga centrioles ay doble din (kung mayroon sila, siyempre).

G2-phase, kung saan mayroong paghahanda para sa mitosis.

Ang magkakaibang mga cell na hindi na nahahati ay maaaring kulang sa G1 phase sa cell cycle. Ang nasabing mga cell ay nasa resting phase G0.

Ang panahon ng paghahati ng cell (phase M) ay may kasamang dalawang yugto:

karyokinesis (nucleus division);

cytokinesis (dibisyon ng cytoplasm).

Sa turn, ang mitosis ay nahahati sa limang yugto.

Ang paglalarawan ng cell division ay batay sa data ng light microscopy kasama ng microfilming at sa mga resulta ng light at electron microscopy ng fixed at stained cells.

Mga probisyon ng cell theory ng Schleiden-Schwann

1 Lahat ng hayop at halaman ay binubuo ng mga selula.

2 Ang mga halaman at hayop ay lumalaki at umuunlad sa pamamagitan ng paggawa ng mga bagong selula. 3 Ang selula ay ang pinakamaliit na yunit ng buhay, at ang buong organismo ay

koleksyon ng mga cell.

Ang mga pangunahing probisyon ng modernong teorya ng cell 1 Ang isang cell ay isang elementarya, functional unit ng istraktura ng lahat ng nabubuhay na bagay. (Maliban

mga virus na walang cellular na istraktura)

2 Ang cell ay isang solong sistema, kabilang dito ang maraming natural na magkakaugnay na mga elemento, na kumakatawan sa isang holistic na pormasyon, na binubuo ng mga conjugated functional unit - organelles.

3 Ang mga selula ng lahat ng organismo ay homologous.

4 Ang cell ay nangyayari lamang sa pamamagitan ng paghahati sa mother cell.

5 Ang multicellular organism ay isang kumplikadong sistema ng maraming mga cell na nagkakaisa at isinama sa mga sistema ng mga tisyu at organo na konektado sa isa't isa.

6 Ang mga selula ng mga multicellular na organismo ay totipotent.

7 Ang isang cell ay maaari lamang lumabas mula sa isang nakaraang cell.

Ang mga probisyong ito ay nagpapatunay sa pagkakaisa ng pinagmulan ng lahat ng nabubuhay na organismo, ang pagkakaisa ng lahat organikong mundo. Salamat sa teorya ng cell, naging malinaw na ang cell ang pinakamahalagang bahagi ng lahat ng nabubuhay na organismo.

Ang isang cell ay ang pinakamaliit na yunit ng isang organismo, ang hangganan ng divisibility nito, pinagkalooban ng buhay at lahat ng mga pangunahing katangian ng isang organismo. Bilang isang elementarya na sistema ng pamumuhay, pinagbabatayan nito ang istraktura at pag-unlad ng lahat ng mga buhay na organismo. Sa antas ng cellular, ang mga katangiang ito ay ipinahayag

buhay, bilang ang kakayahan sa metabolismo at enerhiya, autoregulation, pagpaparami, paglago at pag-unlad, pagkamayamutin.

9. Cytoplasm. Pangkalahatang morphofunctional na katangian. Hyaloplasm, ang mga katangiang physico-kemikal nito at kahalagahan sa buhay ng cell.

Cytoplasm (mula sa Greek κύτος "cell" at πλάσµα dito "content") - ang panloob na kapaligiran ng isang buhay o patay na cell, maliban sa nucleus at vacuole, na limitado ng plasma membrane. Kabilang dito ang hyaloplasm - ang pangunahing transparent na substansiya ng cytoplasm, ang obligadong mga bahagi ng cellular sa loob nito - mga organelles, pati na rin ang iba't ibang mga di-permanenteng istruktura - mga pagsasama. Minsan ang hyaloplasm lamang ang nauunawaan bilang cytoplasm.

Ang terminong "cytoplasm" ay ipinakilala ni Edward Strasburger noong 1882.

Ang cytoplasm ay naglalaman ng organic at mga di-organikong sangkap maraming uri. Ang pangunahing sangkap ng cytoplasm ay tubig. Maraming mga sangkap (halimbawa, mga mineral na asing-gamot, glucose, amino acid) ang bumubuo ng isang tunay na solusyon, ang iba pa (halimbawa, mga protina) ay bumubuo ng isang koloidal. Halos lahat ng mga proseso ng cellular metabolism ay nagaganap dito. Sa iba pang mga bagay, sa cytoplasm mayroong mga hindi matutunaw na mga produkto ng basura ng mga metabolic na proseso at mga reserbang nutrients.

Ang cytoplasm ay patuloy na gumagalaw, dumadaloy sa loob ng isang buhay na cell, na gumagalaw kasama nito ang iba't ibang mga sangkap, inklusyon at organelles. Ang kilusang ito ay tinatawag na cyclosis. Ang cytoplasm ay may kakayahang paglaki at pagpaparami at, kung bahagyang inalis, maaaring maibalik. Gayunpaman, ito ay gumagana nang normal lamang sa pagkakaroon ng nucleus. Kung wala ito, ang cytoplasm ay karaniwang hindi maaaring umiral nang mahabang panahon, gayundin ang nucleus na walang cytoplasm.

Ang pinakamahalagang papel ng cytoplasm ay ang pag-iisa ng lahat ng mga istruktura ng cellular (mga bahagi) at tinitiyak ang kanilang pakikipag-ugnayan ng kemikal. Nagsasagawa rin ito ng iba pang mga function, lalo na, sinusuportahan nito ang cell turgor.

Sa loob ng cell ay ang cytoplasm. Binubuo ito ng isang likidong bahagi - hyaloplasm (matrix), organelles at cytoplasmic inclusions.

Hyaloplasm

Hyaloplasm - ang pangunahing sangkap ng cytoplasm, ay pumupuno sa buong puwang sa pagitan ng lamad ng plasma, ang shell ng nucleus at iba pang mga intracellular na istruktura. Ang Hyaloplasm ay maaaring ituring bilang isang kumplikadong sistemang koloidal na maaaring umiral

sa dalawang estado: sol-like (likido) at gel-like, na magkaparehong pumasa sa isa

iba pa. Sa proseso ng mga paglipat na ito, ang ilang gawain ay isinasagawa, ang enerhiya ay ginugol. Ang Hyaloplasm ay walang anumang partikular na organisasyon. Ang kemikal na komposisyon ng hyaloplasm: tubig (90%), mga protina (mga enzyme ng glycolysis, metabolismo ng asukal, nitrogenous base, protina at lipid). Ang ilang mga cytoplasmic na protina ay bumubuo ng mga subunit na nagdudulot ng mga organel tulad ng centrioles, microfilament.

Mga function ng hyaloplasm:

1) ang pagbuo ng isang tunay na panloob na kapaligiran ng cell, na pinagsasama ang lahat ng mga organelles at tinitiyak ang kanilang pakikipag-ugnayan;

2) pagpapanatili ng isang tiyak na istraktura at hugis ng cell, na lumilikha ng suporta para sa panloob na pag-aayos ng mga organelles;

3) tinitiyak ang intracellular na paggalaw ng mga sangkap at istruktura;

4) pagtiyak ng sapat na metabolismo kapwa sa loob ng cell mismo at sa panlabas na kapaligiran.

Mga pagsasama

Ang mga ito ay medyo hindi matatag na mga bahagi ng cytoplasm. Kabilang sa mga ito ay:

1) reserbang nutrients na ginagamit ng cell mismo sa mga panahon ng hindi sapat na paggamit ng mga nutrients mula sa labas (sa panahon ng cellular starvation) - mga patak ng taba, starch o glycogen granules;

2) mga produkto na ilalabas mula sa cell, halimbawa, mga mature secretion granules sa secretory cell (gatas sa mga lactocytes ng mammary glands);

3) ballast substance ng ilang mga cell na hindi gumaganap anumang partikular na function (ilang pigment, hal lipofuscin ng senescent cells).

10. Embryology bilang agham ng pag-unlad ng embryo. Mga yugto ng pag-unlad ng embryo, mga kritikal na panahon sa pag-unlad ng embryo.

Ang embryology ay ang agham ng pag-unlad at istraktura ng embryo ng tao.

Ang mga gawain ng medikal na embryology ay ang pag-aaral ng: progenesis, ang mga yugto ng embryogenesis (mula sa pagpapabunga hanggang sa sandali ng kapanganakan), ang mga mekanismo ng embryogenesis, mga karamdaman sa pag-unlad ng embryonic, ang paglitaw ng mga sanhi ng mga karamdaman sa pag-unlad, ang pag-aaral ng mga kritikal na panahon, ang pagbuo ng mga hakbang sa pag-iwas at ang pag-aaral ng postnatal development (i.e. pag-unlad pagkatapos ng kapanganakan ) hanggang sa panahon ng buong pagbuo ng lahat ng mga organo at sistema ng katawan.

AT nakikilala ang pag-unlad: Makasaysayang pag-unlad organismo (phylogenesis) at indibidwal na pag-unlad ng organismo (ontogenesis). Sa ontogenesis, ang embryogenesis at postnatal development ay nakikilala.

Ang pinakamaagang paraan ng pag-aaral ng embryology ay ang deskriptibong pamamaraan, pagkatapos ay ang comparative at experimental (pangunahing artipisyal na insemination) na mga pamamaraan.

AT Ang embryogenesis ay nahahati sa mga panahon:

Pagpapabunga;

Paghihiwalay;

kabag;

Histogenesis;

Organogenesis;

Systemogenesis;

- pagbuo ng katawan sa kabuuan.

Sa proseso ng embryogenesis, ang mga kritikal na panahon ay nakikilala, kapag ang mga kadahilanan ng kaunting lakas ay maaaring maging sanhi ng pinakamataas na pagbabago sa pag-unlad. Kasama sa mga panahong ito ang:

- progenesis (pagbuo ng mga selula ng mikrobyo);

- proseso ng pagpapabunga;

Paghihiwalay;

kabag;

Pagtatanim (7-8 araw);

Histogenesis;

Organogenesis;

Systemogenesis;

Inunan (3-8 na linggo);

- ang proseso ng panganganak ng isang bata, kabilang ang pagbabago ng kapaligiran mula sa tubig patungo sa hangin.

11. Mga Tampok maagang yugto pag-unlad ng tao. Ano ang isang zygote at paano ito nabuo? Mga uri ng pagdurog sa mga vertebrates at tao.

Zygote (mula sa ibang Greek ζυγωτός - ipinares, nadoble) - isang diploid (naglalaman ng kumpletong dobleng hanay ng mga kromosom) na nabuo bilang isang resulta ng pagpapabunga (pagsasama ng isang itlog at tamud). Ang zygote ay isang totipotent (iyon ay, may kakayahang gumawa ng anumang iba pang) cell. Ang termino ay ipinakilala ng German botanist na si E. Strasburger.

Sa mga tao, ang unang mitotic division ng zygote ay nangyayari humigit-kumulang 30 oras pagkatapos ng pagpapabunga, dahil sa mga kumplikadong proseso ng paghahanda para sa unang cleavage division. Ang mga cell na nabuo bilang resulta ng pagdurog sa zygote ay tinatawag na blastomeres. Ang mga unang dibisyon ng zygote ay tinatawag na "cleavage divisions" dahil ang cell ay tiyak na nahahati: ang mga cell ng anak na babae ay nagiging mas maliit pagkatapos ng bawat dibisyon, at walang yugto ng paglaki ng cell sa pagitan ng mga dibisyon.

Mayroong 2 pangunahing uri ng cleavage: Holoblastic - ang buong cytoplasm ng itlog ay kasangkot sa proseso ng cleavage; Meroblastic - hindi lahat ng cytoplasm ay kasangkot. Ang mga oligo- at alicital na itlog ay sumasailalim sa holoblastic cleavage. Ang holoblastic fragmentation ay nahahati sa: radial at spiral. Ang Radial ay katangian ng echinoderms, lancelets at mammals. Ang spiral ay napupunta, kumbaga, sa isang spiral at ang mga blastomeres ay lumiliko

mahigpit na pagtiklop. Ito ay sinusunod sa mga worm, molluscs. Ang mababaw na pagdurog ay katangian ng mga insekto na may sentrong mukha na itlog. Meroblastic discoidal, kapag ang germinal disc lamang na matatagpuan sa yolk ay durog. Sa cephalopods, meroblastic bilateral. Discoidal cleavage sa isda, reptilya at ibon. Sa mga mammal, ang radial fragmentation ay tinatawag na rotational (circular) synchronous. Pagkatapos ng unang pagdurog, ang isa ay nahahati sa radial, at ang isa sa ekwador. Ito ay asynchronous cleavage: simula pagkatapos ng yugto ng 2 blastomeres, ang isang blastomere ay nahahati, at ang pangalawa ay hindi nahahati. Sa mga mammal, ang mga blastomeres ay matatagpuan nang maluwag sa isa't isa at ang proseso ay nagtatapos sa compaction. Cleavage sa isang mollusk: 1) una sa medial plane; 2) pagkatapos ng ika-4 na pagdurog, hindi ito pare-pareho: ang mas mababang tier ay nahahati sa 2 hindi pantay na mga cell (malaking macro- at maliit na micromeres, at mga mesomer sa itaas ng mga ito). Mula sa pagdurog na ito ng mga layer ng mikrobyo ay inilatag. Sa Palaka, ang unang cleavage furrow ay hindi pa umabot sa vegetative pole, ngunit ang 2nd furrow ay nabubuo na. Sa poste ng hayop ay nabuo maliit na lukab- blastocoel. Ang palaka ay may kulay abong karit. Ang panlabas na layer ng cytoplasm ay mas siksik, na naglalaman ng mga butil. Kapag ang isang spermatozoon ay tumagos, ito ay kinabibilangan ng mga butil sa likod nito. Ang cytoplasm pagkatapos ay umiikot ng 30 degrees. - isang grey crescent ay nabuo. Spiral cleavage: Ang mga blastomeres ay maaaring magkapareho o magkaiba. Ang bawat blastomere sa ika-4 na yugto ay nakikipag-ugnayan sa isa't isa. Ang mga cavity sa loob ay hindi nabuo, o isang maliit na isa ay nabuo. Meroblastic bilateral cleavage: ang kanan at anterior side ay simetriko, ngunit ang upper at lower side ay magkaiba. Ang Drosophila ay may 9 na hakbang na proseso. Ang nucleus ay durog at ang nuclei ay napupunta sa paligid sa kahabaan ng mga tulay. Doon, ang bawat blastomere ay nahahati ng 4 na beses. Sa pagitan ng mga ito, ang isang lamad ng plasma ay nabuo sa pagbuo ng blastoderm. Sa yugto ng 512 blastomeres, nabuo ang mga polar germ cell.

13. Histo- at organogenesis sa 2-3 linggo ng pag-unlad. Mesenchyme, pagbuo, istraktura at papel sa pagbuo ng mga tisyu.

Sa ika-2 - ika-3 linggo, i.e., sa panahon ng ikalawang yugto ng gastrulation at kaagad pagkatapos nito, ang mga pangunahing kaalaman ng mga axial organ ay inilatag:

1) chord;

2) neural tube;

3) tubo ng bituka.

Sa panahon sa pagitan ng I at II phase ng gastrulation, i.e., mula ika-9 hanggang ika-14 na araw, isang extraembryonic mesenchyme at tatlong extraembryonic na organo ang nabuo - chorion, amnion, yolk sac

Pag-unlad, istraktura at pag-andar ng chorion. Sa proseso ng pagtatanim ng blastocyst, ang trophoblast nito, habang tumagos ito, mula sa isang solong layer ay nagiging isang dalawang-layer at binubuo ng isang cytotrophoblast at isang sympathotrophoblast. Ang Sympathotrophoblast ay isang istraktura kung saan naglalaman ang isang solong cytoplasm malaking numero nuclei at cell organelles. Ito ay nabuo sa pamamagitan ng pagsasanib ng mga selula na itinulak palabas ng cytotrophoblast. Kaya, ang embryoblast, kung saan nangyayari ang unang yugto ng gastrulation, ay napapalibutan ng isang extra-embryonic membrane, na binubuo ng cyto- at symplastotrophoblast.

Sa proseso ng pagtatanim, ang mga selula mula sa embryoblast ay pinaalis sa lukab ng blastocyst, na bumubuo ng isang extra-embryonic mesenchyme, na lumalaki mula sa loob hanggang sa cytotrophoblast.

Pagkatapos nito, ang trophoblast ay nagiging tatlong-layered - ito ay binubuo ng isang symplastotrophoblast, isang cytotrophoblast at isang parental sheet ng extra-embryonic mesenchyme at tinatawag na chorion (o villous membrane). Sa buong ibabaw ng chorion mayroong mga villi, na sa una ay binubuo ng cyto- at symplastotrophoblast at tinatawag na pangunahin. Pagkatapos ang extra-embryonic mesenchyme ay lumalaki sa kanila mula sa loob, at sila ay nagiging pangalawa. Gayunpaman, unti-unti, sa karamihan ng chorion, ang villi ay nababawasan at napanatili lamang sa bahaging iyon ng chorion na nakadirekta sa basal layer ng endometrium. Kasabay nito, ang villi

lumalaki, lumalaki ang mga sisidlan sa kanila, at sila ay nagiging tersiyaryo.

Sa panahon ng pag-unlad ng chorion, dalawang panahon ay nakikilala:

1) ang pagbuo ng isang makinis na chorion;

2) pagbuo ng villous chorion.

Ang inunan ay kasunod na nabuo mula sa villous chorion.

Mga function ng chorionic:

1) proteksiyon;

2) trophic, gas exchange, excretory at iba pa, kung saan ang chorine ay bahagi, bilang isang mahalagang bahagi ng inunan at kung saan ang inunan ay gumaganap.

Pag-unlad, istraktura at pag-andar ng amnion. Ang extraembryonic mesenchyme, na pumupuno sa lukab ng blastocyst, ay nag-iiwan ng mga maliliit na lugar ng blastocoel na katabi ng epiblast at hypoblast. Ang mga lugar na ito ay bumubuo sa mesenchymal anlage ng amniotic vesicle at yolk sac.

Ang amnion wall ay binubuo ng:

1) extra-embryonic ectoderm;

2) extraembryonic mesenchyme (visceral layer).

Ang mga function ng amnion ay ang pagbuo ng amniotic fluid at isang protective function.

Pag-unlad, istraktura at pag-andar ng yolk sac. Ang mga cell na bumubuo sa extra-embryonic (o yolk) endoderm ay pinaalis mula sa hypoblast, at, lumalaki mula sa loob ng mesenchymal anlage ng yolk sac, bumubuo sa dingding ng yolk sac kasama nito. Ang dingding ng yolk sac ay binubuo ng:

1) extra-embryonic (yolk) endoderm;

2) extraembryonic mesenchyme.