Mga paraan ng pag-alis bacterial endotoxins mula sa biological sample.

Sa isang malawak na kahulugan, ang ibig sabihin ng mga endotoxin ay mga bacterial toxic substance na mga structural component ng bacteria. Ang isang partikular at pinakakaraniwang nabanggit na endotoxin ay lipopolysaccharides (LPS). lipopolysaccharides - mga bahagi ng istruktura lamad ng gramo-negatibong bakterya, pinapanatili ang katatagan ng lamad. Mayroong humigit-kumulang dalawang milyong LPS molecule bawat Escherichia coli cell. Sa kabila ng katotohanan na ang mga endotoxin ay medyo mahigpit na nakagapos sa lamad ng cell, sila ay pinakawalan sa panahon ng paghahati at pagkamatay ng mga selula ng bakterya. bacterial endotoxins. presensya bacterial endotoxins sa mga gamot, lalo na ang mga ginagamit para sa intravenous administration, ay kumakatawan sa isang malaking problema. Bagaman ang mga endotoxin mismo ay hindi nakakalason na mga sangkap, ang kanilang pagpasok sa katawan ay aktibo immune system- ang proseso ay pangunahing nangyayari sa pamamagitan ng pag-activate ng mga monocytes at macrophage - na humahantong sa pagpapalabas ng isang bilang ng mga anti-inflammatory mediator, tulad ng tumor necrosis factor (TNF), interleukins (lalo na ang IL-6 at IL-1) at iba pang mga ahente . Ang pagbuo ng isang cascade anti-inflammatory reaction, na sinamahan ng pagtaas ng temperatura at lagnat (tinatawag na endotoxic shock), ay maaaring nakamamatay.

Kung ikukumpara sa mga protina, bacterial endotoxins napaka stable. Ang kanilang katatagan ay pinananatili sa mataas na halaga temperatura at higit sa isang malawak na hanay ng pH.

Ang mga akdang naglalarawan sa nakakalason na epekto pagkatapos ng intravenous administration ng mga solusyon na inihanda mula sa bacterial culture at hindi naglalaman ng mga microorganism ay nagsimulang i-publish sa pagtatapos ng ika-19 na siglo. At ang bilang ng naturang mga gawa ay patuloy na tumataas.

Noong 1912, sinimulang gamitin nina Hort at Penfold ang terminong "pyrogenic" upang tukuyin ang mga solusyon na nagdudulot ng febrile state. Noong 1945, inilathala ni Westphal ang isang papel kung saan inilarawan niya ang isang polysaccharide complex na matatagpuan sa panlabas na layer ng bacterial wall na may pyrogenic effect.

Sa mga sumunod na taon, inilathala ni Westphal ang ilang higit pang mga papel kung saan ipinagpatuloy niya ang pag-aaral ng liposaccharides mula sa iba't ibang enterobacteriaceae. Sa mga sumunod na taon, ang molekular na organisasyon ng mga endotoxin at ang mekanismo ng kanilang epekto sa katawan ay patuloy na pinag-aralan.

Tinatawag din na polysaccharides (LPS), sila ang pangunahing bahagi ng panlabas na lamad ng gram-negative bacteria (tingnan ang Fig. 1).

Figure 1: Molecular model ng panloob at panlabas na lamad mula sa E. coli K-12
Mga hugis: ang mga oval at parihaba ay kumakatawan sa mga nalalabi ng asukal, ang mga bilog ay kumakatawan sa mga polar working group ng iba't ibang lipid.
Mga pagdadaglat: PPEtn (ethanolamine pyrophosphate); LPS (lipopolysaccharide); Kdo (2-keto-3-deoxyoctonic acid).

Ang mga ito ay binubuo ng isang hydrophilic polysaccharide residue, na konektado sa pamamagitan ng isang covalent bond sa isang hydrophobic lipid residue (lipid A) (tingnan ang Fig. 2).

Ang liposaccharide ng karamihan sa mga bacterial species ay binubuo ng tatlong pangunahing mga bloke:
- O-antigen block (rehiyon ng O-antigen),
- core oligosaccharide,
- lipid A (lipid A).

Ang O-antigen ay pangunahing binubuo ng isang pagkakasunud-sunod ng magkaparehong oligosaccharides (mula tatlo hanggang walong monosaccharides bawat isa), na tumutukoy sa pagtitiyak ng mga species at serological na katangian ng kaukulang bacterium.
Ang core oligosaccharide ay may isang konserbadong istraktura na may panloob na 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid (KDO)-heptose na rehiyon at panlabas na lugar na binubuo ng hexoses. Halimbawa, sa mga E. coli species mayroong limang kilala iba't ibang uri pangunahing rehiyon.Ang Lipid A ay ang pinaka-conserved na bahagi ng endotoxin at responsable para sa karamihan mga katangiang biyolohikal endotoxin, kabilang ang para sa biological toxicity nito. Ang mga bacterial strain na kulang sa lipid A o endotoxin sa kanilang lamad ay hindi kilala sa modernong agham.

Figure 2: Kemikal na istraktura ng endotoxin mula sa E. coli
(Hep) L-glycerol-D-manno-heptose; (Gal)galactose; (Glc) glucose; (KDO) 2-keto-3-deoxyoctonic acid; (NGa)N-acetylgalactosamine; (NGc) N-acetyl-glucosamine.

Ang molecular weight ng endotoxin monomer ay karaniwang nasa pagitan ng 10 at 70 kDa. Ngunit mayroon ding ilang mga pagbubukod: 2.5 kDa na may maikling O-antigen hanggang 70 kDa na may napakahabang O-antigen. Ang mga cell ay "nakakawala" ng mga endotoxin sa malalaking dami sa panahon ng kamatayan nito, gayundin sa panahon ng proseso ng paglaki at paghahati. Ang mga endotoxin ay lumalaban sa mataas na temperatura at hindi nawasak sa ilalim ng karaniwang mga kondisyon ng autoclaving. Ang mga endotoxin ay maaari lamang sirain sa pamamagitan ng paggamit ng mga sumusunod na mode: 250 °C sa loob ng 30 minuto o 180 °C nang higit sa 3 oras. Ang paggamit ng mga acid at alkalis na may konsentrasyon na hindi bababa sa 0.1 M ay maaari ring humantong sa pagkasira ng mga endotoxin.

Mga paraan ng pagtanggal ng endotoxin

Mayroong ilang mga paraan na ginagamit upang alisin bacterial endotoxins: ion exchange chromatography, affinity sorbents, gel filtration, ultrafiltration, centrifugation sa isang sucrose gradient, paggamit ng two-phase separation system.

Ang paraan ng pag-alis ay tinutukoy ng sukat at pagiging posible sa ekonomiya. Ang ultrafiltration at ion exchange chromatography ay karaniwang ginagamit upang alisin ang mga endotoxin mula sa malalaking volume. Ang ultrafiltration ay napaka-epektibo para sa pag-alis ng mga endotoxin mula sa tubig at may tubig na mga solusyon, ngunit ito ay ganap na hindi angkop para sa pag-alis ng mga endotoxin mula sa mga solusyon na naglalaman ng mga protina o mga nucleic acid. Ang parehong disadvantages ng ultrafiltration ay nalalapat sa ion exchange chromatography. Ang paggamit ng mga affinity sorbents, kadalasang hindi kumikilos sa agarose, Sepharose, acrylamide at iba pang mga carrier, ay marahil ang pinaka. epektibong paraan pagtanggal bacterial endotoxins. Ang mga pangunahing disadvantages ng diskarteng ito: 1. ang tagal ng proseso ng pag-alis (kinakailangan na paulit-ulit na ipasa ang sample sa pamamagitan ng haligi; ang daloy ng rate ay hindi maaaring mataas, dahil ito ay humahantong sa pagpapapangit ng sorbent), 2. pagbabanto ng sample sa panahon ng proseso ng purification ay maaaring mula 10 hanggang 100-fold, 3. ang halaga ng isang affinity sorbent ay maaaring maging napakataas.

Ang two-phase separation system ay ang pinakamurang at pinaka-epektibong paraan upang alisin ang mga endotoxin. Ang pangunahing prinsipyo ng pamamaraang ito ay ang pagbuo ng isang two-phase micellar system dahil sa pagdaragdag ng solusyon sa tubig polimer na bumubuo ng micelle. Bakterya na endotoxin ay nakuha ng mga nagresultang micelles mula sa may tubig na hydrophilic na bahagi at nananatili sa hydrophobic na kapaligiran sa panahon ng paghihiwalay ng phase (tingnan ang Fig. 3).

Figure 3: Schematic ng two-phase micellar separation na dulot ng pagtaas ng temperatura.
Ang mga micelles ay maaari ding naroroon sa aqueous phase, ngunit ang kanilang sukat ay mas maliit kaysa sa mas mababang hydrophobic na bahagi.

Gamit ang tatlong cycle ng paggamot na may dalawang-phase system, ang mga antas ng endotoxin sa lahat ng mga recombinant na protina na ginawa mula sa E. coli ay nababawasan ng higit sa 99%. Sa kasong ito, ang biological na aktibidad at mga katangian ng mga protina mismo ay hindi sumasailalim sa mga pagbabago.
Ang kawalan ng isang two-phase system ay na pagkatapos ng paghihiwalay ay palaging may ilang halaga ng idinagdag na micelle-forming polymer na natitira sa aqueous phase. Ang ilang mga mananaliksik ay naniniwala na ang mga impurities ng polimer na ito ay may Negatibong impluwensya na may karagdagang paggamit ng mga gamot na pinadalisay sa ganitong paraan. Pinabulaanan ng ibang mga mananaliksik ang negatibong epekto ng mga negatibong epekto. Ang aming karanasan sa paggamit ng mga gamot na na-purified mula sa bacterial endotoxin gamit ang biphasic micellar system, parehong in vitro at in vivo, ay hindi nagpakita ng anumang negatibong epekto sa alinman sa mga cell o hayop kung saan ang mga purified na gamot ay pinangangasiwaan.
Tila, ang pagtatrabaho sa naturang sistema ay nangangailangan ng ilang mga kasanayan at ang kanilang kakulangan ay maaaring magpakita mismo sa mga kasunod na resulta.

Pagpapasiya ng endotoxins

Upang matukoy ang mga endotoxin, ang LAL test (LAL: Limulus Amebocyte Lysate) ay ginagamit bilang pamantayan. Mula noong dekada sitenta, pinalitan ng pagsusulit na ito ang dating ginamit na tinatawag na "pyrogenic test", nang ang gamot na pansubok ay ibinibigay sa mga kuneho. Ang mga kuneho ay napakasensitibo sa mga endotoxin at ang kanilang reaksyon sa mga iniksyon na gamot sa mahabang panahon nagsilbing tagapagpahiwatig ng pyrogenicity.
Sa kasalukuyan, ang EAA test (EAA: Endotoxin Activity Assay) ay ginagamit na rin. Ang pagsusulit na ito ay binuo ng Spectral Diagnostics Inc. (www.spectraldx.com) at nagbibigay-daan sa iyong makita ang antas ng mga endotoxin sa dugo.
Sa pamamagitan ng internasyonal na pag-uuri Ang konsentrasyon ng endotoxin ay ipinahayag sa EU (endotoxin units): EU/ml o EU/mg. Ang isang yunit (1 EU) ay katumbas ng humigit-kumulang sa 100 pg ng endotoxin. Ang isang Gram-negative bacterial cell ay naglalaman ng humigit-kumulang 10-15g o 1 fg ng endotoxin, kaya ang 1 EU ay ginawa ng 105 bacteria. Ang 1 ml ng isang magdamag na kultura ng E. coli ay naglalaman ng mula 5 108 hanggang 109 na mga cell, na tumutugma sa hanggang 10,000 EU bawat 1 ml ng kultura.

Ang pinakamataas na pinahihintulutang antas ng endotoxin sa intravenous administration- 5 EU bawat kg ng katawan sa loob ng isang oras.

Batay sa mga materyales mula sa isang artikulo ng Silex JSC. Mga reagents para sa pag-alis ng mga endotoxin. www.sileks.com

Dermatovenereology, Pambansang pamumuno, 2011, p.99-110

Intestinal endotoxin at pamamaga

M.Yu. Yakovlev

Modernong antas siyentipikong kaalaman nagpapahintulot sa iyo na magbigay ng pamamagaMayroon akong sumusunod na kahulugan: “Ang pamamaga ay isang mekanismong pang-emergencyimmune defense na naglalayong kilalanin, sirainat pag-aalis ng mga dayuhan at self-antigens, dalaadaptive at/o pathogenic sa kalikasan." Sa ibang salita,Ang pagsunog ay palaging isang mapanirang proseso, kahit na ito ay mahalaga kailangan.

Isang interdisciplinary na kahulugan na binuo sa III kongreso lipunang Ruso mga pathologist, batay sa mga turoI.I. Mechnikov "Sa papel salik ng bituka sa mga mekanismo ng isang daanrhenia"; Ang konsepto ni G. Selye na "General Adaptation Syndrome" O unang dahilan hindi tiyak na mga kadahilanan; "Clonallyselection theory of immunity" ni F. Burnet at "Endotoxin mga konsepto ng pisyolohiya at patolohiya ng tao."

Ang mga siyentipikong teoryang ito ay nagpasigla sa klinikal, molekularsiyentipiko at genetic na mga pag-aaral na naging posible na mag-systematizedating nakuha na data sa gawain ng likas at adaptive na kaligtasan sa sakit, ang kanilang pakikipag-ugnayan sa isa't isa at nakakahawamga ahente. Kaalaman tungkol sa aspetong ito ng problema hanggang kamakailanay pira-piraso at hindi pinahintulutan kaming makakuha ng malinawmga konsepto tungkol sa mga mekanismo ng regulasyon ng immune system ng bitukaendotoxin sa antas ng buong organismo at ang pakikilahok ng pangkalahatan"hindi tiyak" na mga kadahilanan sa pagpapatupad at pagsisimula ng pamamagaleniya, dahil walang partisipasyon kadahilanan ng sistema imposible atmga lokal na pagpapakita nito.

Endotoxin - thermostable bahagi ng panlabas na bahagi ng lamad ng cell ng lahat ng mga gramo-negatibong mikroorganismo, lipopolysaccharide(LPS), na binubuo ng 3 bahagi: hydrophobic lipid A - glycolipid muling- chemotype na kapareho ng endotoksyns ng lahat ng gram-negative microorganisms; hydrophilic core at polysaccharide, na indibidwal at nagbibigay-daan sa iyong maniwalamakahawa sa gram-negative microorganism gamit ang serolohikal na pamamaraan ng pananaliksik. Ang pagkakaroon ng isang glycolipid sa isang molekula ng LPS ng iba't ibang pinagmulan ay tumutukoy sa kanilang pagkakaparehobiological properties: pyrogenic at antitumor effecttov, ang kakayahang i-activate ang cell differentiation myelocyticpaglaki ng utak ng buto at lipid peroxidation,pasiglahin ang antiviral at antibacterial immunity,

magbuod ng disseminated intravascular coagulation syndromes atmultiorgankakulangan.

Ang buong natatanging spectrum ng biological na aktibidad ng endotoxins hanggang sakamakailan lamang (hanggang 1987-1988) ay itinuturing na eksklusibo sa sep na formatsisa at iba pa Nakakahawang sakit, sa pathogenesis kung saan ito ay ipinapalagayang nangungunang papel ng LPS ng exogenous gram-negative bacteria. Ang pakikilahok ng endotoxin ng bituka sa pathogenesis ng "hindi nakakahawang patolohiya", at lalo na sa mga proseso ng physiological ng pagbagay, ay hindi isinasaalang-alang. Ito ay ipinapalagay na sa malusogSa pamamagitan ng kahulugan, hindi dapat magkaroon ng lason (endotoxin) sa katawan. Ganun din sa akinAng may-akda ng kabanatang ito ay kasangkot din sa pananaliksik, sa ngayon sa tulong ng mga highly purified antibodies sa Re -glycolipid sa peripheral blood smears ng halos malulusog na pasyenteAng LPS na naayos sa ibabaw ay hindi nakita polymorphonuclear leukocytes.

Ginawa nitong posible na mag-postulate ng isang bagong biological phenomenon - isang systemicendotoxemiaat magmungkahi ng mahalagang papel para sa bituka LPS sa regulasyonaktibidad ng immune at pagsisimula ng pamamaga. Una, ang mga bagong pamamaraan ng pananaliksik ay binuo, ang isang karaniwang hanay ay itinatag ("physiological gical") mga tagapagpahiwatig ng konsentrasyon ng endotoxin sa serum at damiLPS-positibopolymorphonuclear leukocytes sa peripheral bloodmalusog na kondisyong mga boluntaryo; pagkatapos ay ang katotohanan ng pakikilahok ng labis na LPS sa pathogenesis ng iba't ibang mga sakit ay itinatag, na kasunod na tinawag na "endotoxinpagsalakay"; at sa wakas, natukoy ang mga likas na immune receptor Niteta - TLR 4, pakikipag-ugnayan sa LPS at pagtukoy ng aktibidad ng immune walang sistema.Kaya, na-verify ang isa sa mga pangunahing elementodating postulated systemic endotoxemia, ang molekularmga mekanismo immunoregulatory pagkilos ng bituka LPS, natanto, pati na rindati nang ipinapalagay, na may direktang partisipasyon ng hypothalamic-pituitary-adrenal system. Stress (pisikal, psycho-emosyonal, ng ibang etiology) ay nagdudulot ng karagdagang paglabas ng portal na dugo na "mayaman" sa bituka na endotoxin sa pamamagitan ng portacaval anastomoses, na lumalampas sa atay, patungo sa pangkalahatang daloy ng dugo. Sa isang estado ng kamag-anak na pahinga, i.e. sa kawalan ng mga stressorsimpluwensya, higit sa 95% ng portal na dugo ay pumapasok sa atay, kung saan ang lahat ng LPSinalis ng nakapirming macrophage system. Ang atay ang pinaka "kailangan"ibinigay" sa endotoxins organ, dahil kapag nakikipag-ugnayan sila sa TLR 4V macrophage ibuyo ang synthesis ng pinakamahalaga pro-namumula mga cytokine bago, na nagbibigay ng pangunahing physiological tone ng antitumor, antibacterial at antiviral immunity 1. Ang LPS ay hindi natupok ng atay bumabalik sa bituka na may apdo, ngunit malamang na walang polysaccharide mga bahagi.Ang bahagi ng endotoxin (mas mababa sa 5%) ay pumapasok sa pangkalahatang dugo na may portal na dugo. hemocirculationat pinapanatili ang lahat sa isang estado ng pisyolohikal na tono immunocompetentmga organo ( Utak ng buto, thymus, atbp.) at mga cell ( pagpapakita ng antigen, polymorphonuclear leukocytes, lymphocytes, atbp.). kaya, sistematikoAng endotoxemia ay gumaganap ng isang napakahalagang tungkulin sa pagtiyak ng pisyolohikal na tono ng immune system. Sa mga hindi pangkaraniwang sitwasyon(takot, takot, orgasm, mag-ehersisyo ng stress), laging may kasamang stress,Ang immunostimulating effect ng endotoxemia ay tumataas habang ang konsentrasyon ng bituka LPS sa pangkalahatang daloy ng dugo ay tumataas. Obviously, kaya naman physioAng mga lohikal na konsentrasyon ng mga endotoxin ay nagbabago-bago sa isang napakalawak na saklaw (mula sa malapit sa zero hanggang 1.0 EU/ml ) at magkaroon ng isang matatag na ugali na tumaasmay edad. napaka sa mga bihirang kaso Hindi posible na makita ang LPS sa serum (o sa halip,ang konsentrasyon nito ay mas mababa sa 0.0001 EU/ml ). Para sa mga pasyenteng itoNagreresulta ito sa isang makabuluhang pagbaba sa mga pangunahing tagapagpahiwatig ng katayuan ng immune. Gayunpaman, mayroon ding hindi pangkaraniwang bagay ng endotoxin tolerance - ang kawalan ngmatinik pyrogenic reaksyon sa sapat na mataas (makabuluhang lumalampasitaas na limitasyon ng normal) na mga konsentrasyon ng endotoxin sa dugo. Para sa pagpapatupadbiological na katangian ng endotoxin (sa partikular, para sa pakikipag-ugnayan ng LPS sa TLR 4) high density lipoproteins (HDL) ay kinakailangan LPS-binding proteinthein (isang acute phase protein na na-synthesize ng atay) na nagpapadala ng mga endotoxin CD receptor 14, at ilang iba pang mga molekula ng protina at cofactor. Kakapusanisa o higit pa sa mga salik sa itaas, karamihan sa mga itosynthesized sa atay, maaaring maging sanhi immunodeficient mga kondisyon na kadalasang nangyayari kapag gumagamit ng mga anti-inflammatory na gamot sa mga pasyenteng may pagkabigo sa atay at mga pasyente mula sa konsentrasyonAng tion ng LPS sa pangkalahatang daloy ng dugo ay mas mababa sa 0.0001 EU/ml.

1 NIto marahil ang dahilan kung bakit ang mga hayop na gnotobiont ay halos walang pagtatanggol laban sa impeksyonmi at mas malamang na maging madaling kapitan mga sakit sa oncological. Mga hayop na "walang mikrobyo".ay pinagkaitan ng immunostimulating effect ng bituka LPS, dahil wala silang gram-negativemicroflora. (Tandaan, may-akda)

Para sa mas holistic na pag-unawa sa materyal na ipinakita, itinuring namin itong maipapayomaikling balangkasin ang mga pangunahing prinsipyo kung paano gumagana ang immune systemmga sistema at pakikipag-ugnayan ng likas at adaptive na kaligtasan sa sakit.

Likas na kaligtasan sa sakit sanhi ng aktibidad ng ilang daanrespiratory genes na tinitiyak ang synthesis ng kaukulang bilang ng mga receptor.Sila ang mga lumahok sa paglaban sa impeksyon sa unang 3-5 araw (bago ang pagbuoclones ng lymphocytes at ang pagbuo ng isang pool ng mga tiyak na antibodies) dahil sa pag-activate ng pandagdag, ang pagkilos ng antimicrobial peptides at ang aktibidad ng phagocytes. Bilang karagdagan, ang likas na kaligtasan sa sakit ay "nag-aayos" ng gawain ng adaptive, sa partikularito, dahil sa pakikipag-ugnayan ng LPS sa TLR 4 2 at edukasyon ng pangunahing pro-namumula mga cytokine na tinitiyak ang pagpapatupad ng isang tiyak na tugon ng immune.Kaya, ang evolutionarily mas sinaunang likas na immune systemkinokontrol ang "mas bata" na adaptive.

Adaptive immunity higit sa lahat ay ibinibigay ng isang random na prosesosomatic mutations ng lymphocytes, bilang isang resulta kung saan lumilitaw ang mga receptor,may kakayahang makilala ang anumang (kahit na sintetikong) antigen, kabilang ang mga autoantigen, antibodies ( AT ) na kung saan ay patuloy na naroroon sa pangkalahatang daluyan ng dugo.Ang bilang ng naturang mga receptor sa ilalim ng mga kondisyong pisyolohikal ay umabot sa astronomiyamga halaga. Ang prinsipyong ito ng adaptive immunity organization ay nagpapahintulot sa amin na matiyak maaasahang sistema pagprotekta sa katawan mula sa mga impeksyon at potensyalang mapaminsalang mutasyon, sa isang banda, at sa kabilang banda, ay nagdudulot ng malaking panganibpinsala sa autoimmune. Mukhang sa panimula ito ay mahalagana ang likas na kaligtasan sa sakit ay kasangkot sa regulasyon ng prosesong ito, ang aktibidad kung saan, sa turn, ay higit na tinutukoy ng konsentrasyon ng LPS sa pangkalahatan daluyan ng dugo.

Ang likas at adaptive na kaligtasan sa sakit ay gumagana nang magkasabay, na maaaring ilarawan ng halimbawa ng mga phagocytes, na isinaaktibo din ng bituka.endotoxin. Pinakamalaking populasyon immunocompetent mga selulaay nasa tuktok ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng likas at adaptive na kaligtasan sa sakit dahil sapresensya sa ibabaw nitoFc-mga receptor na may kakayahang tumanggap

lahat ng AT , na nangangahulugang partikular na nakikipag-ugnayan sa iba't ibang uri ng antigenes, na nagpapahintulot sa amin na makilala ang neutrophil bilang isang phagocyte multispecificmga aksyon, na dati ay nakatago sa ilalim ng terminong “ non-specificity».

Sa ilalim ng mga kondisyong pisyolohikal, 5-7% ng mga nagpapalipat-lipat na leukocyte ang nagdadalaibabaw ng LPS, at humigit-kumulang sa parehong bilang ng mga phagocytesnagbubuklod tayo ng mga endotoxinsa vitro. Kapag nakikipag-ugnayan sa LPS, phagocyticang potensyal ng neutrophils at ang kanilang malagkit na aktibidad ay tumaas. Sila ay aalis naang vascular bed, at pagkatapos ay ang katawan (bilang bahagi ng excreta: feces, ihi, pawis, atbp.), ay gumaganap ng proteksiyon na function ng "kamikaze border guards" sa stroma ng mga organo atmga tisyu sa direktang pakikipag-ugnay sa panlabas na kapaligiran.

kaya, sistematiko endotoxemia (EE) - mekanismo ng regulasyon tion ng immune activity ng bituka LPS na may direktang pag-aaral mga kondisyon ng hypothalamic-pituitary-adrenal system. Stress pagigingisang katangian ng buhay mismo, sa isang banda ito ay nagbibigay ng iniksyon sa pangkalahatang daluyan ng dugokaragdagang bahagi ng unibersal immunostimulant, at sa kabilang banda - ang fieldmakapangyarihan ang mga liriko pro-namumula ang epekto ng labis nito ay nadagdagan ang synthesisglucocorticoids(Larawan 8-1). Nagreresulta ito sa isang napaka-hindi matatag na estado.tinatawag na "balanse" katayuan ng immune", na sa mga kondisyon ng sapateksaktong mahabang panahon ng pagbagay ( pangmatagalang stress) Maaaringsira. Maaaring tumaas ang konsentrasyon ng bituka LPS sa pangkalahatang sirkulasyon lumampas sa physiologically mga wastong halaga(puro sila ay indibidwal at mayroon mga katangian ng edad) at nagsisilbing tanging dahilan para sa pagsisimulalokal nagpapasiklab na reaksyon(o paglala nito) at systemic syndromenagpapasiklab na tugon, na may mas malaki o mas mababang kalubhaan na palaging kasama ng pamamaga (pagtaas sa temperatura ng katawan, mga konsentrasyon ng protinatalamak na yugto, ESR;leukocytosis, atbp.). Apagbagay ng katawan sa patuloy na pagbabago ng panlabas at panloob na kapaligiran ay direktang kasangkot sa regulasyonaktibidad ng immune at pagsisimula ng pamamaga, hindi direkta sa pagtaaskonsentrasyon ng endotoxin ng bituka sa pangkalahatang daloy ng dugo. Kaya stressmaaaring ang tanging dahilan para sa pagbuo ng pagsalakay ng endotoxin at, bilang ang kahihinatnan ay pamamaga.

kanin. 8-1. Systemic endotoxemia - balanseng immune status.

kanin. 8-2. Ang pagsalakay ng endotoxin bilang sanhi ng pamamaga.

Endotoxin pagsalakay- proseso ng pathological na sanhi ng labiscom LPS ng bituka at/o iba pang pinagmulan sa pangkalahatang daluyan ng dugo, pagkakaroonang clinical at laboratory manifestations nito, ay isang "pre-disease" o uniisang pangkalahatang pangkalahatang kadahilanan sa pathogenesis ng mga sakit at sindrom, na ipinakita ng isa o isa pang nosological na anyo ng sakit dahil sainstitusyonal at/o nakuhang predisposisyon 3. Ang station wagon na itoAng makabuluhang epekto ng pagsalakay ng endotoxin ay natanto sa hindi bababa sa tatlong paraan:induction ng mga reaksyon ng autoimmune (dahil sa mga katangian ng adaptive immunity), pagbuo hyperergic immune background at pagiging agresibo sa sarilileukocytes. Ang mga dahilan para sa pagbuo ng pagsalakay ng endotoxin ay magkakaiba: ang pinaka-karaniwan ay ang stress, pati na rin ang anumang mga pathological na proseso na humahantong sa pagtaas ng pagkamatagusin ng bituka na hadlang (pagkalason sa pagkain at talamak mga impeksyon sa bituka, labis na alkohol at dysbacteriosis, hindi pangkaraniwang taba at maanghang na pagkain, maanghang mga impeksyon sa viral, pagkabigla, atbp.), portal hypertension at mga sakit sa atay, talamak at talamak na pagkabigo sa bato (dahil ang mga bato ay nagsisilbing pangunahing LPS-excreting organ).Pinaka malinawmekanismo pro-namumula mga aksyon sa isang napakasimpleng anyo (Fig. 8-2)maaaring kinakatawan ng halimbawa ng pangmatagalang stress ( psycho-emosyonal labis na karga, depresyon, hyper- at hypothermia, matinding pisikal na aktibidad, atbp.).

3 Ang pagpapakilala ng terminong ito ay nauna sa maraming taon ng pananaliksik sa maraming domesticat mga dayuhang siyentipiko, kabilang ang paglikha ng mga pamamaraan na magagamit para sa klinikal na kasanayan para sa pagtukoy ng mga mahalagang tagapagpahiwatig ng konsentrasyon at aktibidad ng LPS antiendotoxinkaligtasan sa sakit, kahulugan karaniwang mga tagapagpahiwatig. Kaya naman sa kabanatang ito ay lilimitahan lamang natin ang ating mga sarili sa pinakamahalaga sa kanila. (Tandaan, may-akda)

Stress-inducedpro-namumula ang epekto ng endotoxins sa pagtukoysa isang mas mababang lawak ay napigilan ng kabaligtaran na epekto glucocorticoids. Para saang synthesis ng mga hormone na ito ay gumagamit ng kolesterol na pumapasok sa cortexang mga adrenal gland na eksklusibo sa kumbinasyon ng mga high-density lipoproteins (HDL), ang affinity nito para sa LPS ay mas mataas kaysa sa kolesterol. Iyon ang dahilan kung bakit ang labis na endotoxin ay nagdudulot ng kakulangan ng HDL, na bahagyang humaharang sa synthesis. glucocorticoids at humahantong sa pagtaas pro-namumulaepekto. Bilang isang resulta, ito ay umuunlad hypercholesterolemia at tumataas" atherogenic index" iyon mahabang taon ay maling itinuturing na isang pagpapakita ng isang paglabagmetabolismo ng lipid at ang batayan para sa pagbuo ng atherosclerosis. Sa kasalukuyan ay kakauntina may mga pagdududa tungkol sa nagpapasiklab na kalikasan ng atherosclerosis, lalo na ang papel ng "endothelial dysfunction" sa pagsisimula nito (endothelial dysfunction, sa turn, ay sapilitan ng endotoxin aggression, na hinulaan noong 1987). Ang konsepto na ito ay lubos na nakakumbinsi na nakumpirma sa pamamagitan ng pagbawas sa konsentrasyon ng "atherogenic" na mga praksyon ng lipoproteins (mababa at napakababa.mababang density) na may pagbaba sa antas ng nilalaman ng LPS (<1,0 EU/ml) sa serum ng dugo.

Inilabas sa kapaligiran sa panahon ng buhay ng microorganism. Mga endotoxin ay matatag na nauugnay sa bacterial cell at inilabas sa kapaligiran pagkatapos ng cell death.

Mga katangian ng endo at exotoxins.

Ang mga exotoxin ay bumubuo ng mga causative agent ng tinatawag na nakakalason mga impeksyon, na kinabibilangan ng diphtheria, tetanus, gas gangrene, botulism, ilang uri ng staphylococcal at streptococcal infection.

Ang ilang bakterya ay sabay-sabay na gumagawa ng parehong exo- at endotoxin (Escherichia coli, Vibrio cholerae).

Pagkuha ng mga exotoxin.

1) pagpapalaki ng isang nakakalason na kultura (exotoxin-forming) sa isang likidong nutrient medium;

2) pagsasala sa pamamagitan ng bacterial filter (paghihiwalay ng exotoxin mula sa bacterial cells); Maaaring gumamit ng iba pang paraan ng paglilinis.

Pagkatapos ay ginagamit ang mga exotoxin upang makagawa ng mga toxoid.

Pagkuha ng toxoids.

1) Ang 0.4% na formalin ay idinagdag sa solusyon ng exotoxin (pagsala ng isang kultura ng sabaw ng mga nakakalason na bakterya) at itinatago sa isang thermostat sa 39-40°C sa loob ng 3-4 na linggo; mayroong pagkawala ng toxicity, ngunit ang mga antigenic at immunogenic properties ay napanatili;

2) magdagdag ng preservative at adjuvant.

3) pangkalahatang physiological reaktibiti ng katawan; ito ay tinutukoy ng mga physiological na katangian ng macroorganism, ang likas na katangian ng metabolismo, ang pag-andar ng mga panloob na organo, mga glandula ng endocrine, at ang mga katangian ng kaligtasan sa sakit.

Sa heneral apektado ang physiological reactivity:

A) kasarian at edad: may mga impeksyon sa pagkabata (scarlet fever, whooping cough, tigdas, beke), malubha ang pulmonya sa katandaan, sa panahon ng pagbubuntis ang mga babae ay mas sensitibo sa staphylococcal at streptococcal infection, hanggang 6 na buwan ang mga bata ay lumalaban sa maraming impeksyon, dahil tumanggap ng mga antibodies mula sa ina;

b) estado ng nervous system: ang depresyon ng sistema ng nerbiyos ay nag-aambag sa isang mas matinding kurso ng impeksiyon; binabawasan ng mga karamdaman sa pag-iisip ang pag-andar ng regulasyon ng central nervous system;

V) pagkakaroon ng mga sakit sa somatic(diabetes, sakit ng cardiovascular system, atay, bato);

G) estado ng normal na microflora, na ang mga kinatawan ay may antagonistic na katangian;

d) nutrisyon: na may hindi sapat at malnutrisyon, ang mga tao ay mas madalas na madaling kapitan ng mga nakakahawang sakit (tuberculosis, dysentery, cholera), habang ang mga bahagi ng protina ng pagkain, bitamina at microelement ay pinakamahalaga, dahil kinakailangan ang mga ito para sa synthesis ng mga antibodies at pagpapanatili ng aktibong phagocytosis; bilang resulta ng gutom, hindi lamang indibidwal, kundi pati na rin ang kaligtasan sa mga species ay maaaring mawala; kakulangan ng mga bitamina ay humahantong sa metabolic disorder, na binabawasan ang paglaban sa mga impeksiyon;

e) mga tampok ng immunobiological organismo, i.e. katatagan ng mga likas na proteksiyon na kadahilanan.

Endotoxin o, para gumamit ng mas tumpak na termino, ang bacterial lipopolysaccharide (LPS), ay itinuturing na pinakamakapangyarihang microbial mediator na kasangkot sa pathogenesis ng sepsis at septic shock. Kahit na ang kadahilanang ito ay natuklasan higit sa isang daang taon na ang nakalilipas, ang pangunahing papel ng endotoxin, na naroroon sa sistematikong sirkulasyon ng karamihan sa mga pasyente na may septic shock, ay hindi pa naitatag at ito ay paksa ng malaking kontrobersya. Ang LPS ay ang pinakamahalagang "signal molecule", na nakikita ng maagang sistema ng babala ng natural na kaligtasan sa sakit ng host bilang isang harbinger ng pagpasok ng mga gram-negative na microorganism sa panloob na kapaligiran ng katawan. Ang mga maliliit na dosis ng LPS sa isang limitadong espasyo ng tissue ay tumutulong sa host body na ayusin ang epektibong antimicrobial na proteksyon at alisin ang mga pathogen sa panlabas na kapaligiran. Kasabay nito, ang biglaang pagpapakawala ng isang malaking halaga ng LPS, sa kabaligtaran, ay may masamang epekto sa katawan ng host, dahil sa kasong ito ito ay nag-trigger ng isang hindi makontrol at nagbabanta sa buhay na paglabas ng maraming nagpapaalab na mediator at procoagulants sa systemic daluyan ng dugo. Ang isang malinaw na tugon ng host sa molekula na ito, na kinikilala ang pagpapakilala ng bakterya sa panloob na kapaligiran ng katawan, ay sapat na upang maging sanhi ng nagkakalat na pinsala sa endothelial, tissue hypoperfusion, disseminated intravascular coagulation at refractory shock. Maraming mga pagtatangka na hadlangan ang aktibidad ng endotoxin, na isinagawa sa balangkas ng mga klinikal na pag-aaral na isinagawa sa mga populasyon ng mga pasyente na may sepsis, ay nailalarawan sa pamamagitan ng magkasalungat at higit sa lahat ay negatibong mga resulta. Gayunpaman, sa nakaraang dekada, ang mga makabuluhang pagtuklas ay ginawa sa molecular na batayan ng LPS-mediated cellular activation at tissue damage, na nagpabago ng optimismo tungkol sa posibleng tagumpay ng mga bagong henerasyong therapies na naglalayong partikular na harangan ang LPS signaling system.

Ito ngayon ay pinaniniwalaan na ang iba pang mga microbial mediator na
ay bahagi ng istraktura ng gram-positive bacteria, virus at fungi, at may kakayahang mag-activate ng maraming host defense system na apektado ng LPS.

Ang endotoxin ay umiikot sa daluyan ng dugo at nagtataguyod ng pag-activate ng mga monocytes at macrophage. Bilang resulta, ang mga tagapamagitan, kabilang ang mga cytokine, ay inilabas at ang mga paborableng kondisyon ay nilikha para sa systemic na pamamaga na dulot ng impeksiyon. Ang endotoxin ay isang trigger para sa pagpapalabas ng mga cytokine at mediator. Ang pagkakaroon ng mga endotoxin sa dugo ay tinatawag endotoxemia. Kung malakas ang immune response, maaaring humantong sa endotoxemia septic shock. Ito ay pinaniniwalaan na ang pag-target sa endotoxin at ang mabilis na pag-alis nito mula sa katawan ay ang pinakamahalagang gawain sa paggamot ng sepsis.

Ang terminong "pyrogen" ay nagmula sa Greek na "pyreto" - lagnat. Ang mga pyrogen ay mga sangkap na maaaring magdulot ng pagtaas ng temperatura ng katawan. Ang mga reaksyon ng pyrogenic ay maaaring sanhi ng mga sangkap ng iba't ibang kalikasan at pinagmulan. Kasama sa mga pyrogen ang mga gramo-negatibong bakterya at ang kanilang mga lason, mga bakteryang positibo sa gramo at ang kanilang mga lason, mga virus at kanilang mga produktong metaboliko, pati na rin ang mga steroid, atbp. Sa larangan ng kontrol sa kalidad ng mga injectable na gamot, ang mga ito ay praktikal na kahalagahan bacterial endotoxins, na mga fragment ng panlabas na pader ng gram-negative bacteria.

Ang Gram-negative bacteria ay may double-layered cell wall na pumapalibot sa cytoplasmic membrane. Ang unang layer ay isang napakanipis (1 nm makapal) non-lipid lamad na binubuo ng peptidoglycan. Tinatawag din itong glycopeptide o mucopeptide. Ito ay isang kumplikadong matrix na naglalaman ng mga polysaccharide chain na naka-link sa isa't isa sa pamamagitan ng cross-linking short peptide chain. Ang pangalawang layer ng cell wall ay isang lipid membrane na may kapal na 7.5 nm. Sa panlabas na lamad na ito matatagpuan ang mga endotoxin (lipopolysaccharides). Ang mga molekula ng endotoxin ay nagbibigay ng integridad ng istruktura at responsable para sa maraming mga pag-andar ng pisyolohikal, kabilang ang pagtukoy sa mga pathogen at antigenic na katangian ng bakterya. Sa istruktura, ang molekula ng endotoxin ay nahahati sa tatlong bahagi - Lipid A, Core At O-specific na chain.


O-specific na chain na Core Lipid A
Lipid A binubuo ng disaccharide, phosphate at fatty acids. Ang mga fatty acid na bumubuo sa Lipid A ay maaaring saturated o unsaturated. Ang pinakakaraniwang mga acid na nilalaman sa Lipid A ay: palmitic, lauric, glutamic, at meristik. Ang rehiyon ng Lipid A ay ang pinaka-pare-parehong rehiyon ng molekula ng LPS, at ang istraktura nito ay katulad sa maraming bakterya.
O-specific na chain Ang lipopolysaccharides ay binuo mula sa paulit-ulit na oligosaccharides. Ang pinakakaraniwang sugars na bumubuo sa O-specific na chain ay glucose, galactose, at rhamnose. Ang bahaging ito ng molekula ay nagbibigay ng hydrophilic na mga katangian, dahil sa kung saan ang LPS ay lubos na natutunaw sa tubig. Ang bahagi ng polysaccharide ay ang pinaka-variable na bahagi ng molekula ng LPS. Ang fragment na ito ng molekula ay madalas na tinatawag na O-antigen, dahil ito ay responsable para sa antigenic na aktibidad ng gram-negative bacteria.
Core- ang gitnang bahagi ng molekula na nagbubuklod sa O-antigen sa Lipid A. Sa pormal, ang istraktura ng core ay nahahati sa panlabas at panloob na mga bahagi. Ang panloob na bahagi ng core ay karaniwang naglalaman ng mga residue ng L-glycero-O-mannoheptose at 2-keto-3-deoxyoctonic acid (KDO). Ang KDO ay naglalaman ng 8 carbon atoms at halos wala sa ibang lugar sa kalikasan.
Bilang karagdagan sa lipopolysaccharides, ang panlabas na pader ng gram-negative na bakterya ay kinabibilangan din ng mga protina (ang panlabas na lamad ay ¾ LPS, at ¼ lamang ang mga bahagi ng protina). Ang mga protina na ito, kasama ang LPS, ay bumubuo ng mga protina-lipopolysaccharide complex na may iba't ibang laki at molecular weight. Ang mga complex na ito ay tinatawag na bacterial endotoxins. Ang mga purified na paghahanda na ginagamit bilang mga pamantayan ay walang mga peptide fragment at kumakatawan sa isang purong paghahanda ng lipopolysaccharide. Gayunpaman, ang terminong "bacterial endotoxins" ay inilapat nang pantay-pantay sa mga natural na endotoxin na lumilitaw sa solusyon bilang resulta ng pagkasira ng bacterial at sa mga purong paghahanda ng LPS.
Ang panlabas na dingding ng isang gramo-negatibong bacterium ay maaaring maglaman ng hanggang 3.5 milyong LPS molekula. Pagkatapos ng kanyang kamatayan, lahat sila ay nagtatapos sa solusyon. Ang mga endotoxin ng gram-negative bacteria ay nananatiling biologically active molecules kahit na pagkamatay ng bacteria. Ang molekula ng endotoxin ay matatag sa temperatura at madaling makatiis sa ikot ng isterilisasyon ng autoclave. Ang maliit na sukat ng mga molekula ng endotoxin ay nagbibigay-daan sa kanila na madaling dumaan sa mga lamad na ginagamit upang isterilisado ang mga solusyon (0.22 microns). Samakatuwid, ang mga endotoxin ay maaaring naroroon sa mga natapos na form ng dosis, maging ang mga ginawa sa ilalim ng mga kondisyong aseptiko at sumasailalim sa panghuling isterilisasyon.
Ang mga bacterial endotoxin ay lubhang aktibo (malakas) na mga pyrogen. Para sa pagbuo ng isang febrile attack, ang pagkakaroon ng bacterial endotoxins sa infusion solution sa isang konsentrasyon ng 1 ng/ml (mga 10 EU/ml) ay sapat. Ang iba pang mga pyrogens ay hindi gaanong aktibo, at para sa pagbuo ng isang pyrogenic na tugon ang kanilang konsentrasyon ay dapat na 100-1000 beses na mas mataas. Karaniwan, ang mga terminong "pyrogens" at "endotoxins" ay ginagamit nang palitan at, bagama't hindi lahat ng pyrogens ay endotoxin, ang pinakamahalaga ay ang mga endotoxin ng gram-negative na bakterya.