Реакция Кумбса - эффективный метод выявления антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител крови человека в непрямой реакции агглютинации. Основа теста - использование при типировании антигенов эритроцитов специфических моноклональных реагентов на основе иммуноглобулинов класса G (IgG) с последующим применением на втором этапе реакции антиглобулиновой сыворотки Кумбса (АГС).

АГС производится путем смешивания сыворотки из крови лабораторных животных, иммунизированных иммуноглобулинами класса G человека, и моноклональных антител к одному из компонентов - C3D комплементу сыворотки человека. АГС вызывает агглютинацию эритроцитов, сенсибилизированных специфическими антителами. При отсутствии антител на эритроцитах под воздействием АГС положительная реакция не происходит.

Непрямая реакция Кумбса позволяет определить наличие:

• антигенов эритроцитов, выявляемых IgG-реагентами («неполными» антителами, например, моноклональными реагентами анти-D, анти-F Y a , анти-F Y b);
• антиэритроцитарных антител класса IgG.

Непрямой антиглобулиновый тест: выявление антигенов эритроцитов

Приводим методику непрямой реакции Кумбса на примере цоликлона анти-D IgG.

1. Промаркируйте чистую пробирку: укажите ФИО исследуемого лица.
2. Внесите в пробирку 2 капли (приблизительно 0,1 мл) цоликлона анти-D IgG.
3. Добавьте 2 капли 5 % взвеси предварительно отмытых физиологическим раствором анализируемых эритроцитов. Смешайте исследуемые образцы с цоликлоном.
4. Инкубируйте смесь на водяной бане или в термостате при 37 °С на протяжении 30 минут.
5. Добавьте в пробирку пастеровской пипеткой 5 - 10 мл физраствора.
6. Центрифугируйте пробирку с центробежным ускорением 1200 g при 18 - 25 °С на протяжении одной минуты.
7. Удалите физраствор.
8. Повторно проведите процедуру отмывки эритроцитов с помощью центрифугирования еще 2 - 3 раза.
9. Добавьте 2 капли антиглобулиновой сыворотки к осадку кровяных телец, выполните перемешивание.
10. Центрифугируйте пробирку с центробежным ускорением 1200 g в течение минуты при температуре 18 - 25 °С.
11. Добавьте с помощью дозатора или пастеровской пипетки 3 - 5 капель физраствора.
12. Ресуспендируйте осадок и визуально оцените наличие агглютинации. Выраженные агглютинаты на дне пробирки на фоне прозрачного раствора свидетельствуют об обнаружении антигена эритроцитов. Непрозрачная суспензия кровяных телец говорит об отсутствии антигена.

Реакция Кумбса: скрининг изоиммунных антиэритроцитарных антител

Исследование осуществляется в рамках проведения пробы на индивидуальную совместимость по всем антигенам эритроцитов крови донора и реципиента. Заключение о полной совместимости сыворотки реципиента с эритроцитами донора производят на основании отсутствия гемолиза и/или агглютинации на всех этапах проведения анализа. Признаки гемолиза и/или агглютинации на каком-либо этапе тестирования говорят о несовместимости образцов крови.

Оценка совместимости по системе АВ0, обнаружение «холодовых» антител

1. Приготовьте образец крови донора:
   • внесите в пробирку автоматическим дозатором 0,2 мл крови;
   • 3 раза отмойте эритроциты в 5,0 мл физиологического раствора;
   • ресуспендируйте осадок в 3 - 4 мл раствора с низкой ионной силой LISS.
2. Промаркируйте вторую чистую пробирку: укажите ФИО реципиента и ФИО донора.
3. Внесите автоматическим дозатором 0,1 мл сыворотки реципиента в промаркированную пробирку.
4. Добавьте 2 капли 5 % суспензии эритроцитов в растворе LISS.
5. Без промедления центрифугируйте смесь с центробежным ускорением 1200 g при температуре 18 - 25 °С на протяжении 15 - 20 секунд.
6. Легким покачиванием пробирки отделите осадок от дна. Оцените наличие агглютинатов. Присутствие гемолиза и/или агглютинатов означает:
   • несовместимость по системе АВ0;
   • наличие в сыворотке больного «холодовых» антител класса IgM или IgА, не специфичных к антигенам АВ0.

Выявление «тепловых» антител

1. При отсутствии гемолиза и/или агглютинатов инкубируйте пробирку 10 - 15 минут при 37 °С.
2. Центрифугируйте пробирку при 1200 g на протяжении 15 - 20 секунд при комнатной температуре.
3. Встряхните пробирку и проверьте наличие гемолиза и/или агглютинатов в супернатанте. Положительный результат говорит об обнаружении в сыворотке больного «тепловых» IgM-антител против антигенов эритроцитов донора.

Обнаружение IgG-антител в тесте Кумбса

1. При отрицательном результате на прошлом этапе исследования добавьте в пробирку пастеровской пипеткой 5 мл 0,9 % раствора NaCl.
2. Центрифугируйте пробирку при 1200 g на протяжении 15 - 20 секунд при температуре воздуха 18 - 25 °С. Пастеровской пипеткой аккуратно избавьтесь от супернатанта.
3. Повторно выполните отмывание эритроцитов еще 2 - 3 раза.
4. Добавьте в пробирку 1 - 2 капли антиглобулиновой сыворотки. Выполните тщательное перемешивание.
5. Центрифугируйте пробирку при 1200 g 15 - 20 секунд.
6. Аккуратно разбейте осадок эритроцитов и проведите визуальную оценку результата реакции. Выявление агглютинации означает присутствие в сыворотке больного IgG-антител против антигенов эритроцитов донора.

Из множества существующих антигенов в медицинской практике наибольшее значение уделяется трем типам агглютиногенов крови. Одним из них является тип ответственный за проявление резус-фактора: если он присутствует на мембране эритроцита, диагностируют Rh+ группу крови, если отсутствует - Rh-. Если в состав резус-отрицательной крови попадают эритроциты с агглютиногенами Rh+, организм запускает реакцию иммунного ответа и начинает вырабатывать антитела к этому антигену, что становится причиной патологических состояний.

СПРАВКА! Резус-фактор — сложная многокомпонентная система из нескольких десятков антигенов. Наиболее часто встречаемые из них — агглютиногены типа D (85% случаев), а также E и C.

Пробу Кумбса проводят только при наличии прямых показаний. Общий список причин для назначения пробы Кумбса:

• планирование и ведение беременности (родители имеют разный Rh);
• донорство и подготовка к переливанию крови (несовпадение крови по Rh не менее губительно, чем несовпадение по системе АВ0);
• планируемое хирургическое вмешательство (на случай восполнения кровопотери с помощью переливания крови);
• диагностика гемолитических болезней.

Более конкретные показания зависит от типа проводимого исследования.

Прямая проба Кумбса

Прямой тест позволяет обнаружить антитела на поверхности эритроцитов. Это необходимо для диагностики уже имеющихся гемолитических патологий :

• аутоиммунных (эритроциты и гемоглобин разрушаются в результате атаки антител собственного организма);
• медикаментозных (патологический процесс запускает прием некоторых лекарственных препаратов типа хинидина или прокаинамида);
• посттрансфузионных (при несовпадении группы крови при переливании), а также в виде резус-конфликта при беременности (эритробластоз новорожденных).

СПРАВКА! Гемолитическая анемия - заболевание, связанное с преждевременным разрушением эритроцитов в результате гемолиза, что приводит к недостаточному насыщению крови кислородом и гипоксии головного мозга и/или внутренних органов.

Гемолиз кровяных элементов наблюдается при онкологических, инфекционных, ревматических заболеваниях, поэтому прямая проба Кумбса может использоваться как дополнительное средство диагностики патологического состояния. При этом стоит помнить: отрицательное значение анализа не исключает вероятность гемолиза, а является поводом для дополнительного обследования.

Непрямая проба Кумбса

Непрямая проба чаще применяется для предотвращения патологических ситуаций. Она помогает выявить антитела в плазме крови, что необходимо для оценки совместимости при переливании и диагностики рисков резус-конфликта во время беременности.

Более 80% людей имеют положительный резус-фактор (Rh+), соответственно, чуть менее 20% являются резус-отрицательными. Если у Rh- матери развивается Rh+ ребенок, ее организм начинает вырабатывать антитела, атакующие эритроциты плода, провоцируя гемолиз.

С учетом того, что процент “разнорезусных” браков достигает 12-15%, риск гемолитической болезни новорожденных должен быть велик, но в реальности лишь в 1 из 25 подобных случаев у женщин наблюдается явление сенсибилизации (на 200 успешных родов 1 пример гемолитической патологии). Частично это обусловлено тем, что первый резус-положительный ребенок обычно не вызывает открытой агрессии организма матери; подавляющее количество случаев приходится на второго и последующих детей. Действует тот же принцип, что и при обычной сенсибилизации к тому или иному аллергену.

При первом контакте реакции не происходит. Организм только знакомится с новым для него антигеном, вырабатывая антитела класса IgМ, которые отвечают за быстрый иммунный ответ, но редко проникают через плацентарный барьер в кровь ребенка. Все патологические реакции проявляются при повторной “встрече”, когда в организме начинают вырабатываться антитела класса IgG, легко проникающие в кровоток плода, запуская процесс гемолиза.

Непрямая проба Кумбса при беременности позволяет обнаружить наличие антител в организме матери и вовремя выявить начальную стадию сенсибилизации. Положительный ответ, требует постановки на учет с ежемесячным исследованием титра антител и обязательной госпитализацией за 3-4 недели до родов.

СПРАВКА! Несовместимость по резус-фактору на состоянии матери никак не сказывается, гемолитическая болезнь развивается только у ребенка. В тяжелых случаях и при отсутствии своевременной реакции плод может погибнуть еще в утробе или сразу после рождения.

Подготовка к процедуре и ее проведение

Для диагностики используют венозную кровь. Специальная длительная подготовка к проведению пробы Кумбса не требуется. Старайтесь соблюдать стандартный набор правил перед взятием крови из вены на анализ:

• за 3 суток откажитесь от алкоголя, медикаментозных препаратов (по возможности);
• последний прием пищи планируйте на позже, чем за 8 часов до взятия крови на анализ;
• за 1 час откажитесь от курения, физических, умственных и эмоциональных нагрузок;
• перед процедурой выпейте стакан чистой негазированной воды.

Метод исследования основан на реакции гемагглютинации.

При проведении прямой пробы на образец крови воздействуют заранее заготовленной антиглобулиновой сывороткой с известными показателями, выдерживают смесь некоторое время и проверяют на предмет агглютинатов, которые образуются при наличии на эритроцитах антител. Уровень содержания агглютинатов диагностируют с помощью агглютинирующего титра.

Непрямая проба Кумбса имеет сходную методику, но более сложную последовательность действий. В отделенную сыворотку крови вводят антигенные эритроциты (с резус-фактором) и только после этих манипуляций добавляют антиглобулиновую сыворотку для диагностики и титра агглютинатов.

Результаты исследования

В норме и прямая, и непрямая проба Кумбса должны давать отрицательный результат:

• отрицательная прямая проба свидетельствует о том, что специфические антитела к резус-фактору, связанные с эритроцитами, в крови отсутствуют и не могут являться причиной гемолиза
• отрицательная непрямая проба показывает, что свободные антитела к резус-фактору в плазме крови также отсутствуют; факт свидетельствует о совместимости крови донора с кровью реципиента (или крови матери и ребенка) по резус-фактору.

Положительная проба Кумбса говорит о факте резус-сенсибилизации организма, что является главной причиной резус-конфликта в случае переливания крови или при вынашивании ребенка с иным резус-статусом. В этом случае результаты сохраняются неизменными в течение 3-х месяцев (срок жизни эритроцитов). Если причиной стала аутоиммунная гемолитическая анемия, то положительная проба может преследовать пациента на протяжении нескольких лет (в ряде случаев - всю жизнь).

СПРАВКА! Антиглобулиновый тест отличается высокой чувствительностью, но имеет малую информативность. Он не регистрирует активность гемолитического процесса, не определяет тип антитела и не в состоянии выявить причину патологии. Для получения более полной картины, лечащий врач обязательно назначает дополнительные исследования (микроскопию крови, общий и биохимический анализ, ревмопробы, СОЭ, уровень железа и ферритина).

Степень сенсибилизации может иметь качественное выражение (от «+» до «++++») или количественное - в виде титра:

• 1:2 - низкое значение, не представляет опасности;
• 1:4 - 1:8 - начало развития иммунологической реакции; не представляет опасности, но требует постоянного контроля;
• 1:16 -1:1024 - яркая форма сенсибилизации, следует незамедлительно принять меры.

Причиной положительной пробы могут стать:

• переливание нетипированной крови (или с ошибкой типирования), когда резус-фактор донора и реципиента не совпадают;
• резус-конфликт при беременности (если состав антигенов крови у отца и матери не совпадают);
• аутоиммунная гемолитическая анемия - как врожденная (первичная), так и вторичная, которая является следствием некоторых болезней (синдрома Эванса, инфекционной пневмонии, сифилиса, холодовой гемоглобинурии, лимфомы);
• медикаментозная гемолитическая реакция.

Ни одна из вышеперечисленных проблем не может быть решена пациентом без врачебной помощи. Во всех случаях потребуется срочная консультация, постановка на учет или экстренная госпитализация.

ВНИМАНИЕ! В редких случаях возможна ложноположительная проба Кумбса. Причиной этого могут стать частые переливания крови, а также ряд заболеваний: ревматоидные артриты, красная волчанка, саркоидозы. Также это явление может наблюдаться после удаления селезенки, а также при нарушении хода реакции (частые встряхивания содержимого, наличие загрязняющих примесей).

В последние годы среди пациентов различного возраста увеличилось количество заболеваний крови и для их диагностики используются различные методы и средства. Проба Кумбса является клиническим исследованием крови, и цель ее проведения заключается в выявлении в организме определенных , представляющих угрозу для здоровья человека.

Может произойти приклеивание антител к и результатом этого может стать нарушение состояния иммунной системы. Прямая проба Кумбса представляет собой антиглобулиновый тест, который проводится для выявления антител, прикрепившихся к поверхности эритроцитов.

Обычно специалисты прибегают к проведению теста на антитела в следующих ситуациях:

• Необходимость переливания крови. Из курса школьной анатомии известно, что у человека может быть одна из четырех групп крови. Проведение антиглобулинового теста позволяет определить возможность переливания крови в другой организм. Говорить о том, что пациент может стать донором для переливания можно лишь в том случае, если его кровь соответствует типу больного, то есть в ней присутствуют одинаковые антигены. В том случае, если у пациента и донора существует различие антигенов, то это может привести к тому, что произойдет разрушение иммунной системой перелитых клеток. Результатом этого может стать развитие тяжелых заболеваний и осложнений, и даже летальный исход. Именно по этой причине важную роль придается поиску нужного типа крови при появлении необходимости ее переливания.
• Определение риска резус-сенсибилизации. Современная медицина определяет резус как антиген, а его полным определением является понятие «резус-фактор». Благодаря тесту Кумбса удается диагностировать присутствие антител к резус-фактору в крови женщин во время . В том случае, если будущая мамочка имеет отрицательный резус-фактор, а отец положительный, то будущий ребенок может унаследовать любой из них. При выявлении у будущего ребенка положительного резус-фактора повышается опасность развития резус-сенсибилизации — это процесс смешения крови и матери во время беременности или родовой деятельности.

В том случае, если наблюдается несовместимость группы матери и ребенка, то иммунная система женского организма начинает воспринимать плод как чужеродный предмет и оказывает на него всевозможную атаку. Результатом этого может стать развитие тяжелой патологии у ребенка, которая получила название эритробластоза. В некоторых случаях при отсутствии эффективного лечения наблюдается гибель плода в утробе матери либо сразу же после его рождения.

В некоторых случаях проба Кумбса проводится с целью выявления аутоиммунной гемолитической .

Такое заболевание встречается довольно редко и проявляется в образовании к антигенам эритроцитов своего собственного организма.

Специалисты выделяют две разновидности проб Кумбса, каждая из которых применяется для определенных целей.

Прямая проба. Прямая проба в медицинской практике еще называется прямой антиглобулиновый тест и с его помощью удается диагностировать антитела, прикрепленные к поверхности . В некоторых случаях производство таких антител в организме человека происходит как результат прогрессирования различных либо приема таких лекарственных препаратов, как:

• Хинидин
• Метилдоп
• Прокаинамид

Опасность таких антител кроется в том, что они могут становиться причиной развития и оказывать разрушающее воздействие на . Иногда к проведению теста Кумбса прибегают в том случае, когда необходимо выявить причины развития таких патологий, как анемия и .

У нормой считается отрицательная реакция пробы Кумбса.

Непрямая проба. Часто специалисты прибегают к проведению непрямой пробы Кумбса, которая имеет второе название «непрямой антиглобулиновый тест». Основной целью такого является выявление антител к эритроцитам, которые присутствуют в сыворотке крови. Благодаря такой пробе удается определить, совпадает ли кровь донора с кровью пациента при необходимости ее переливания. Такой анализ является своеобразной пробой на совместимость и благодаря его проведению удается избежать развития неблагоприятной реакции на донорскую кровь.

Обычно такое исследование рекомендуется проходить женщинам во время . У некоторых мамочек в организме могут присутствовать антитела определенного класса, способные проникать через плаценту в кровь будущего ребенка. Результатом такого процесса может стать гемолитическая болезнь плода, а также развитие различных во время беременности.

Подготовка к процедуре и ее проведение

Обычно к проведению процедуры не требуется какая-либо специальная подготовка, а провести можно совершенно в любое время.

Подготовка к диагностике включает в себя следующие моменты:

• в том случае, если анализ будет проводиться у новорожденного, то родителям следует объяснить, что с его помощью удастся диагностировать гемолитическое заболевание
• при присутствии подозрения на развитие у пациента гемолитической болезни ему необходимо разъяснить, что проведение такого анализа поможет определить причины ее развития
• подготовка к анализу не требует каких-либо ограничений в еде и режиме питания
• при проведении анализа у новорожденного, следует сообщить родителям о том, что понадобится забор крови из вены, а также уточнить время проведения процедуры
• необходимо известить пациента о том, что во время наложения жгута и забора крови могут возникать неприятные ощущения
• прием лекарственных препаратов может искажать результаты пробы Кумбса, поэтому за некоторое время до ее проведения их следует отменить

При проведении прямой пробы Кумбса из вены с помощью шприца берется кровь. Перед началом проведения процедуры выполняется тщательная дезинфекция места прокола, а после забора материала для исследования налаживается вата либо стерильная марля. В том случае, если анализ проводится у новорожденных, то кровь берется из пуповины.

При появлении гематомы после забора крови назначается прилаживание согревающих компрессов на место прокола. После проведения процедуры пациент может возобновить прием лекарственных препаратов.

В лаборатории проводится очищение полученной крови и параллельно с этим выполняется отделение красных кровяных телец.

Специалистом проводиться исследование образца с использованием различных реагентов сыворотки и Кумбса, противопоставляемых глобулину человека. В том случае если не происходит слипания эритроцитов и не развивается агглютинации, то можно говорить о положительном результате.

Во время проведения могут возникать следующие осложнения:

• развитие из места забора крови во время исследования
• головная боль, головокружения либо обморок
• развитие кровоизлияния под кожные покровы
• при плохой антимикробной обработке кожных покровов в месте инъекции повышается риск проникновения инфекции в организм

Результаты исследования

Расшифровка — возможные заболевания

У здорового человека в организме отсутствуют антитела к , то есть в норме их не должно быть. В том случае, если проведенное исследование покажет положительную пробу, то это может обозначать присутствие в организме антител на красных кровяных клетках.

Результатом такого патологического состояния может стать разрушение эритроцитов, и обычно оно развивается:

• при системной
• при микоплазменной инфекции
• при инфекционном мононуклеозе
• при гемолитическом заболевании новорожденных
• при медикаментозной гемолитической анемии
• при лимфолейкозе хронического характера
• при аутоиммунной гемолитической анемии
• при несовместимости крови плода и матери

Прямая проба Кумбса часто назначается женщинам во время беременности для определения совместимости крови матери и плода. В том случае, если наблюдается несовместимость материнского организма и будущего ребенка по эритроцитарным агентам, то повышается опасность развития гемолитического заболевания новорожденного.

Резус-положительный ребенок у резус-отрицательной женщины становится причиной развития резус-конфликта.

При такой патологии происходит разрушение эритроцитов будущего ребенка антирезусными телами материнского организма. Попадая в женский организм, красные кровяные тельца плода оказывают стимулирующее действие на иммунную систему матери, и результатом этого становится производство антител к ребенку.

Полезное видео — гемолитические анемии.

Образование в материнском организме таких приводит к агглютинационному тромбозу капилляров и ишемическому некрозу плодных тканей. В результате гемолиза эритроцитов и распада гемоглобина наблюдается образование токсического непрямого в организме плода. Резкое снижение содержания эритроцитов у плода по причине их гемолиз приводит к развитию у ребенка такого заболевания, как анемия.

Низкий уровень и высокая концентрация билирубина значительно осложняют течение болезни. Во время беременности диагностируется множество таких осложнений как:

• угроза выкидыша
• развитие кровотечения
• гестозы
• малокровие
• преждевременная родовая деятельность

Антирезусные тела защищают мать, но в то же время представляют серьезную угрозу для развивающегося плода. Благодаря проведению пробы Кумбса удается вовремя диагностировать такое патологическое состояние женского организма и назначить своевременное лечение. Кроме этого, такой анализ помогает выявлять различные заболевания крови, прогрессирование которых могут привести к смерти пациента.

Гемолитические анемии , вызванные аутоиммунными телами, которые направлены против собственных эритроцитов, точно не выяснены. Однако предполагается, что какие-то факторы (например, вирус, ненормальный белок) так изменяют эритроциты, что организм воспринимает их уже «как нечто чуждое» и вступает с ними в борьбу с помощью антител. По другой теории, направленные против эритроцитов антитела возникают почти случайно в процессе образования ненормальных белковых тел плазмы при некоторых болезнях. Такие белковые тела, точно так же «случайно», могут дать реакции, которые можно использовать для постановки диагноза (например, вирусная пневмония, как известно, дает положительную реакцию Вассермана, положительную реакцию Пауль - Буннеля и реакцию холодовой агглютинации).

Имеются два главных типа аутоантител при гемолитических анемиях, а именно: тепловые антитела (реагируют при 37°) и холодовые антитела (реактивная способность которых усиливается по мере приближения температуры к нулю). Тепловые антитела встречаются чаще Холодовых. Dacie нашел, что тепловые гемолизины встречаются в 2 раза чаще, чем холодовые. Гемолизины и агглютинины не являются принципиально различными антителами: они различаются только характером их действия. Агглютинины агглютинируют эритроциты, а гемолизины делают их более подверженными сложному процессу гемолиза (комплемент!). Аутоантитела, фиксируясь на эритроцитах, образуют комплекс эритроцит - глобин. Этот комплекс выявляется с помощью антиглобиновой пробы Кумбса.

Проба Кумбса проводится с сывороткой Кумбса, для приготовления которой сенсибилизируют кролика сывороткой человека, против которой в сыворотке кролика образуются антитела. При действии такой сенсибилизированной сыворотки на эритроциты человека наступает их агглютинация, если рецепторы эритроцитов заняты блокирующими антителами. Так как эти блокирующие антитела происходят из сыворотки человека, они дают агглютинацию с сывороткой кролика, сенсибилизированной к плазме человека и содержащей преципитины. Эта реакция названа пробой Кумбса; для гемолитической анемии на почве аутоиммунных тел (Lo tit) она почти специфична (подробности см. у Maier).

В общем при гемолитических анемиях с первичным нарушением эритроцитов проба Кумбса отрицательна, а при приобретенных - положительна. Однако из этого правила имеются некоторые исключения: ложноположительная проба Кумбса найдена при кризах конституциональных гемолитических анемий, а в слабой степени - также иногда после спленэктомии, при ревматическом полиартрите, саркоидозе, после частых переливаний крови и при системной красной волчанке. Естественно, что при приобретенных гемолитических анемиях без образования аутоиммунных тел она отрицательна.

Гемолитические анемии , вызванные аутоиммунными телами, можно подразделить на:
а) острые, подострые и хронические формы, а также на
б) идиопатические с неизвестной этиологией и в) симптоматические [вирусная пневмония (только холодовые агглютинины), хронический лимфатический лейкоз, ретикулосаркома, лимфосаркома, системная красная волчанка (преимущественно тепловые, реже холодовые агглютинины), сифилис (холодовые агглютинины), опухоли яичников (Miescher с сотрудниками)).
в) симптоматические [вирусная пневмония (только холодовые агглютинины), хронический лимфатический лейкоз, ретикулосаркома, лимфосаркома, системная красная волчанка (преимущественно тепловые, реже холодовые агглютинины), сифилис (холодовые агглютинины), опухоли яичников (Miescher с сотрудниками)).

Клиника гемолитических анемий , развивающихся под действием аутоиммунных тел, очень разнообразна, и вряд ли поэтому можно нарисовать их общую клиническую картину. Поражаются лица всех возрастов и обоих полов равномерно. Все же идиопатические формы как будто чаще наблюдаются у женщин (Sacks и Workman).

Клиническая картина идиопатической формы изменяется в зависимости от тяжести заболевания. В хронических случаях начало постепенно, болезнь тянется многие годы с частыми обострениями. Тяжесть анемии различна в зависимости от степени гемолиза. Наблюдаются падения гемоглобина до 10%, в других случаях гемоглобин длительно удерживается на 50-60%. Интенсивность ретикулоцитоза и желтушной окраски кожи и сыворотки соответствует степени гемолиза. Билирубин в моче находят очень редко, так как он не проходит через почки, но гемоглобинурия наблюдается. Селезенка в хронических случаях чаще увеличена и может даже достигать очень значительных размеров, в других же случаях она еще прощупывается. Печень редко когда не увеличена.

В крови в большинстве случаев наблюдается макроцитоз, в острых стадиях также много микроцитов, редко отсутствуют нормобластоз и полихромазия, лейкоцитоз может достигать 30 000, тромбоциты в норме. В некоторых случаях, однако, имеется выраженная тромбоцитопения. Evans объясняет эти случаи одновременным наличием антител против тромбоцитов, так что налицо имеются одновременно гемолитическая анемия и тромбоцитопения на почве действия аутоиммунных тел- синдром Эванса (Evans). Осмотическая резистентность слегка понижена, но не в такой степени и не так постоянно, как при конституциональной шаровидноклеточной анемии. Проба на устойчивость к нагреванию (Hegglin- Maier) после 6 часов также может дать незначительный гемолиз (собственное наблюдение), но меньшей степени, чем лри анемии Маркиафава. В моче находят также гемосидерин (собственное наблюдение).

Утверждено приказом Росздравнадзора

по применению «Набора реагентов для определения антигенов и антител системы Резус крови человека»
(АГС для пробы Кумбса)

ТУ 9398-102-51203590-2012

РУ № РЗН 2013/1255 от 11.10.2013

I. ВВЕДЕНИЕ

Стандартная сыворотка для пробы Кумбса содержит специфические гетероиммунные антитела против белка крови человека и предназначена для использования в двух вариантах реакции – прямой и непрямой пробе Кумбса.

Прямая проба Кумбса применяется для определения сенсибилизации эритроцитов in vivo при гемолитической болезни новорожденнных и у больных с аутоиммунной формой хронической гемолитической анемии а также при некоторых других состояниях. Проведение прямой пробы Кумбса заключается в том, что к исследуемым эритроцитам, предварительно отмытым от белков собственной плазмы, добавляется сыворотка для пробы Кумбса. Если эритроциты были сенсибилизированы in vivo, то в результате реакции происходит их агглютинация.

Непрямая проба Кумбса применяется как проба для выявления состояния сенсибилизации организма, позволяющая выявлять антитела, находящиеся в свободном состоянии в сыворотке крови исследуемого лица; как проба на совместимость переливаемой крови, когда исследуется воздействие сыворотки реципиента на эритроциты предполагаемого донора; и как проба для определения различных групповых антигенов в эритроцитах при помощи предварительного воздействия на них стандартных сывороток, содержащих антитела заведомо известной специфичности. Непрямая проба Кумбса (все варианты) производится в два этапа, первым из которых является инкубация исследуемой (или стандартной) сыворотки со стандартными (или исследуемыми) эритроцитами, т. е. сенсибизация эритроцитов in vitro. Второй этап – собственно реакция с сывороткой для пробы Кумбса, которая производится так же, как прямая проба Кумбса.

Конечный результат реакции как в прямой, так и в непрямой пробе Кумбса происходит за счет взаимодействия стандартной сыворотки для пробы Кумбса, с антителами (белком крови человека), фиксированными на эритроцитах. Этот результат проявляется в виде агглютинации эритроцитов. Для наблюдения за агглютинацией следует использовать белую фарфоровую или любую белую пластинку обязательно со смачиваемой поверхностью для того, чтобы наносимые на нее капли хорошо размешивались и не растекались по поверхности пластинки. Перемешанные капли следует слегка размазать по пластинке, приблизительно до размера 2-х копеечной монеты.
II. ПОДГОТОВКА ИНГРЕДИЕНТОВ РЕАКЦИИ

Исследуемую сыворотку для определения в ней наличия и специфичности антител получают из крови обследуемого лица без добавления консерванта. Хранят при температуре + 4–8 0 С не более 2 суток или в замороженном состоянии – срок 1 месяц.

Сыворотку для пробы на совместимость получают таким же способом, но используют со сроком хранения не более 2 суток.

Эритроциты, предназначенные для определения в них тех или иных изоантигенов, заготавливаются с каким-либо консервантом от лица, кровь которого исследуется. Можно также использовать осадок эритроцитов из крови, взятой без консерванта.

При пробе на совместимость используется кровь донора, спущенная через иглу из флакона, приготовленного для переливания.

Во всех случаях эритроциты 3-4 раза отмываются в пробирках от плазмы, путем добавления к одному объему эритроцитов 8-10 объемов изотонического раствора хлорида натрия, с последующим перемешиванием и центрифугированием при 1500-2000 об/мин в течение 5-10 мин (до полного осаждения эритроцитов). После каждого центрифугирования надстой отсасывается.
III. ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИЙ

Испытуемые эритроциты готовят в виде 5% взвеси, для чего одну каплю четырежды отмытых эритроцитов смешивают в пробирке с 19 каплями изотонического раствора хлорида натрия.

Одну каплю (0,05 мл) 5% взвеси эритроцитов переносят на белую пластинку и размазывают. Пластинку покачивают и в течение 3-х минут наблюдают, не наступила ли агглютинация эритроцитов. Если агглютинация не наступила, то сюда же добавляют 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса, капли тщательно перемешивают, после чего пластинку слегка покачивают, затем на одну-две минуты оставляют в покое и снова покачивают. Одновременно в течение 10 минут ведут наблюдение за результатом, который выражается в наличии или отсутствии агглютинации.
Трактовка результатов прямой пробы Кумбса.

Отсутствие агглютинации – отрицательная проба

Наличие агглютинации – положительная проба, что указывает на сенсибилизацию исследуемых эритроцитов, т. е. на абсорбцию на них антител, происшедшую in vivo в организме человека (новорожденного, больного). Если агглютинация исследуемых эритроцитов наступила до добавления к ним сыворотки для пробы Кумбса, результат прямой пробы не учитывается.
2. Непрямая проба Кумбса

Предназначенная для выявления изоантител в сыворотке крови обследуемого лица

Применяется в тех случаях, когда необходимо выяснить, содержатся ли в крови больного, беременной женщины, донора и т. д. изоиммунные антитела неполной формы и установить их специфичность. Для реакции используют сыворотку крови обследуемого лица и стандартные эритроциты заведомо известной специфичности. Среди этих 8-10 или более образцов эритроцитов должны быть различия по факторам других систем и очень важно, чтобы каждый из этих факторов содержался хоты бы в одном образце эритроцитов. Также в панель включаются образцы резус-отрицательных эритроцитов с различными сочетаниями антигенов других систем, так, чтобы среди них имелись Даффи-положительные и Даффи-отрицательные, которые, в свою очередь, делились бы на Келл-положительные и Келл-отрицательные, Кидд-положительные и Кидд-отрицательные и т. д. В качестве отрицательного контроля в реакцию по возможности включают эритроциты того лица, сыворотка которого исследуется.

Техника реакции

В штатив устанавливают ряд центрифужных или других пробирок объемом 3-10 мл, по числу образцов эритроцитов, включенных в реакцию. Пробирки маркируют и, согласно маркировке, вносят в них по 1 маленькой капле (0,01 мл) отмытых стандартных эритроцитов. В каждую пробирку накапывают три капли исследуемой сыворотки, пробирки сильно встряхивают для перемешивания эритроцитов с сывороткой и помещают в термостат при 37 0 С на 45 мин. После инкубации пробирки вынимают из термостата, и эритроциты отмывают путем добавления до верха пробирки изотонического раствора хлорида натрия, перемешивания и последующего центрифугирования. Отмывание повторяют 3-4 раза, каждый раз тщательно отсасывая надстой, затем к отмытым эритроцитам добавляют 2 капли изотонического раствора хлорида натрия для получения приблизительно 5% взвеси (при использовании центрифужных пробирок можно ограничиться двухкратным отмыванием).

1 каплю 5% взвеси эритроцитов из каждой пробирки переносят на белую пластинку, добавляют туда 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса и тщательно перемешивают сыворотку с эритроцитами. Пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают, одновременно наблюдая за результатом реакции в течение 20 минут.

Трактовка результатов

Отсутствие признаков агглютинации (отрицательный результат) во всех образцах значит, что в исследуемой сыворотке не содержится неполных антител к групповым антигенам, которые содержатся в стандартных эритроцитах, включенных в исследование.

Если в некоторых или в большинстве капель, кроме контроля, наблюдается агглютинация , это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся неполные антитела против антигенов эритроцитов. Вопрос о специфичности этих антител решается по сопоставлению положительных и отрицательных реакций с антигенной структурой эритроцитов, включенных в реакцию. Вопрос об активности этих антител решается титрованием.

Пример 1. Агглютинация имела место со всеми образцами эритроцитов, содержащими фактор Rh 0 (D), независимо от наличия и от отсутствия других факторов этой системы и других систем, в то время, как со всеми Rh 0 (D) – отрицательными образцами агглютинации не наблюдалось (так же независимо от наличия или отсутствия других факторов) – это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся неполные антитела анти-резус – Rh 0 (D).

Пример 2 . Агглютинация имела место со всеми образцами эритроцитов, содержацими фактор Даффи, независимо от наличия или отсутствия антигенов системы резус и других систем, в то время, как со всеми Даффи-отрицательными образцами агглютинации не наблюдалось, это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся неполные антитела анти-Даффи.

Дополнение. В случае, если в учреждении не имеется полной панели стандартных эритроцитов, но есть необходимость в исследовании сыворотки на наличие антител, рекомендуется провести исследование с 25-30 произвольно взятыми образцами эритроцитов здоровых лиц группы 0 (I) или одноименной с исследуемой сывороткой. Это даст возможность решить вопрос о наличии или отсутствии антител к большинству антигенов системы Rh-Hr, Даффи, Келл, Кидд.

При получении положительного результата дальнейшее заключение о специфичности выявленных антител может быть решено при специальном исследовании с полной панелью стандартных эритроцитов.

3. Техника проведения непрямой пробы Кумбса, как пробы на совместимость переливаемой крови

Для предупреждения несовместимости при переливании крови, перед трансфузией обязательно должны быть произведены следующие пробы на совместимость:

1. 
   Проба на совместимость по группам крови АВО, которая производится на плоскости при комнатной температуре.
2. 
   Пробы на совместимость по резус-фактору и другим изоантигенам.

Несовместимость по резус-фактору и по некоторым другим изоантигенам может зависеть как от наличия полных антител (определяемых в солевой среде при 37 0 С в пробирках) так и, чаще всего, от неполных антител, для чего наиболее чувствительной является непрямая проба Кумбса.

Одну маленькую (0,01 мл) каплю отмытых эритроцитов донора, взятых через иглу из флакона с кровью, предназначенной для переливания, переносят на дно центрифужной или другой пробирки объемом 3-4 мл и добавляют в нее 3 капли сыворотки больного. Пробирку встряхивают для перемешивания эритроцитов с сывороткой, после чего помещают в термостат при 37 0 С на 45 мин. После инкубации добавляют в пробирку доверху изотонический раствор хлорида натрия, содержимое пробирки перемешивают и центрифугируют 5-10 мин. Такое отмывание эритроцитов повторяют 3 раза, каждый раз тщательно удаляя надстой. При использовании центрифужных пробирок можно ограничиться двухкратным отмыванием. К отмытым эритроцитам добавляют 2 капли изотонического раствора хлорида натрия для получения приблизительно 5% взвеси.

1 каплю 5% взвеси эритроцитов переносят на белую пластинку, добавляют туда 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса и тщательно перемешивают сыворотку с эритроцитами. Затем пластинку слегка покачивают, на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают, одновременно наблюдая результат в течение 20 минут.

Примечание: При несовместимости по резус-фактору агглютинация обычно наступает в течение первой минуты, однако при низком титре резус-антител (или других антител) агглютинация может наступить позже, иногда к двадцатой минуте.
Трактовка результата:

Агглютинаты видны в виде комочков на просветленном или полностью обесцвеченном фоне – это значит, что кровь донора несовместима с кровью реципиента и не может быть ему перелита.

Отсутствие признаков агглютинации означает, что кровь больного не содержит неполных антител к эритроцитам донора в отношении резус-фактора и других изоантигенов, к которым могли образоваться антитела неполной формы.

Непрямая проба Кумбса является чувствительной только в отношении неполных антител.
4. Техника непрямой проба Кумбса для определения антигенной структуры эритроцитов

Данная проба используется для определения наличия или отсутствия какого-либо группового антигена эритроцитов при помощи стандартной сыворотки, содержащей соответствующие антитела в неполной форме.

Наиболее часто непрямая проба Кумбса используется при определении антигенов Келл (К), Даффи (Fy), Кидд (Jk), и также для определения слабого антигена системы резус (Du).

Прежде, чем приступить к определению антигенов, исследуемые эритроциты следует проверить в прямой пробе Кумбса. При положительном результате прямой пробы – определение антигенов непрямой пробой Кумбса провести нельзя и для этой цели нужно применить другие реакции.

Для реакции используют центрифужние или другие пробирки объемом 3-4 мл в количестве трех: одну – для исследуемого образца эритроцитов и две для На дно первой пробирки вносят 1 маленькую (0,01 мл) каплю трижды отмытых испытуемых эритроцитов, во вторую - контрольные эритроциты, содержащие искомый антиген (например, Даффи- положительные) и в третью пробирку – отрицательный контроль (Даффи – отрицательные). Во все пробирки добавляют по 2-3 капли стандартной сыворотки (в данном примере анти-Даффи). Пробирки встряхивают для перемешивания содержимого и помещают в термостат при 37 0 С на 45 мин. После такой инкубации пробирки вынимают из термостата, доливают в них доверху изотонический раствор хлорида натрия, тщательно перемешивают содержимое и центрифугируют при1500-2000 тыс. об/мин в течение 5-10 мин. После центрифугирования надстой тщательно отсасывают и такое отмывание эритроцитов повторяют 4 раза. (При использовании центрифужных пробирок можно ограничиться двухкратным отмыванием).

К отмытым эритроцитам добавляют 2 капли изотонического раствора хлорида натрия для получения приблизительно 5% взвеси. 1 каплю 5% взвеси эритроцитов из каждой пробирки переносят на белую пластинку, к каждой капле эритроцитов добавляют 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают. Пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают, одновременно наблюдая за ходом реакции в течение 20 минут.
Трактовка результатов

Наличие агглютинации эритроцитов (положительный результат) означает, что кровь содержит искомый антиген (в данном примере – кровь Даффи-положительная).

Отсутствие агглютинаци (отрицательный результат) означает, что исследуемая кровь не содержит искомого антигена (Даффи-отрицательная).

Результат учитывается как истиный после проверки контрольных образцов, т. е. в примере при положительном результате с Даффи-положительным образцом и отрицательном – с Даффи-отрицательным образцом.

5. Форма выпуска

Реактив выпускается в жидкой форме во флаконах объемом 5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1%.

6.Хранение

Срок хранения - два года в холодильнике при 2-8°С. Вскрытый флакон годен к использованию при хранении в холо­дильнике в герметично закрытом виде в течение всего срока годности.

Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостнос­ти флакона, наличие хлопьев, истекший срок годности реагента. При составлении рекламации просим указать дату получения, поставщика (если Вы получили товар не от производителя), номер серии, причины, по которым реагент признан негодным. Просим приложить протокол с результатами проверки реагента и 2-3 невскрытых флакона с реактивом
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель ООО «МЕДИКЛОН»: 127276