Способы удаления бактериальных эндотоксинов из биологических образцов.

В широком смысле под эндотоксинами понимают бактериальные токсические вещества, которые являются структурными компонентами бактерий. Частным и наиболее упоминаемым эндотоксином являются липополисахариды (ЛПС). Липополисахариды - структурные компоненты мембран грам-негативных бактерий, поддерживающие стабильность мембраны. На одну клетку Escherichia coli приходится около двух миллионов молекул ЛПС. Несмотря на то, что эндотоксины достаточно прочно связаны с мембраной клеток, в процессе деления и смерти бактериальных клеток происходит высвобождение бактериальных эндотоксинов . Присутствие бактериальных эндотоксинов в препаратах, в особенности применяемых для внутривенного введения, представляет собой огромную проблему. Хотя сами по себе эндотоксины не являются токсическими веществами, их попадание в организм активирует иммунную систему - в основном процесс идет через активацию моноцитов и макрофагов - что приводит к высвобождению целого ряда противовоспалительных медиаторов, таких как фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor - TNF), интерлейкины (особенно IL-6 и IL-1) и других агентов. Развитие каскадной противовоспалительной реакцией, сопровождающейся повышением температуры и лихорадкой (так называемый, эндотоксический шок), может привести к летальному исходу.

По сравнению с белками, бактериальные эндотоксины очень стабильны. Их стабильность сохраняется при высоких значениях температур и в широком диапазоне рН.

Работы, описывающие токсический эффект после внутривенного введения растворов, приготовленных из бактериальных культур и не содержащих микроорганизмов, начали публиковать с конца 19-ого века. И количество подобных работ постоянно увеличивалось.

В 1912 году Hort и Penfold стали использовать термин "пирогенный" (pyrogenic) для обозначения растворов, вызывающих лихорадочное состояние. В 1945 году Westphal опубликовал работу, в которой он описывал полисахаридный комплекс, обнаруженный во внешнем слое бактериальной стенки и обладающий пирогенным эффектом.

В последующие годы Westphal опубликовал еще несколько работ, где он продолжал изучать липосахариды из различных энтеробактерий. В последующие годы молекулярная организация эндотоксинов и механизм их воздействия на организм продолжали изучаться.

Также называемые полисахаридами (ЛПС), являются главным компонентом внешней мембраны грам-негативных бактерий (см. рис. 1).

Рисунок 1: Молекулярная модель внутренней и внешней мембран из E. coli K-12
Формы: овалы и прямоугольники представляют сахарные остатки, кружки - полярный рабочие группы различных липидов.
Сокращения: PPEtn (ethanolamine pyrophosphate); LPS (lipopolysaccharide); Kdo (2-keto- 3-deoxyoctonic acid).

Состоят из гидрофильного полисахаридного остатка, который соединен ковалентной связью с гидрофобным липидным остатком (липид А) (см. рис. 2).

Липосахариды большинства видов бактерий состоят из трех основных блоков:
- блок О-антигена (O-antigen region),
- олигосахарид сердцевины (core oligosaccharide),
- липид А (lipid A).

О-антиген в основном состоит из последовательности одинаковых олигосахаридов (от трех до восьми моносахаридов каждый), определяющих видовую специфичность и серологическую особенность соответствующей бактерии.
Олигосахарид сердцевины имеет консервативную структуру с внутренней областью 3-дезокси-D-манно-2- октулосоновой кислота (KDO) - гептоза и внешней области состоящей из гексоз. Так, например, среди видов E.coli известно пять разных типов сердцевинной области. Липид А является самой консервативной частью эндотоксина и отвечает за большинство биологических свойств эндотоксина, в том числе, за его биологическую токсичность. Бактериальные штаммы, в составе мембраны которых отсутствовал бы липид А или эндотоксин, не известны современной науке.

Рисунок 2: Химическая структура эндотоксина из E. coli
(Hep) L-glycerol-D-manno-heptose; (Gal) galactose; (Glc) glucose; (KDO) 2-keto-3-deoxyoctonic acid; (NGa) N-acetylgalactosamine; (NGc) N-acetyl-glucosamine.

Молекулярная масса мономера эндотоксина обычно составляет от 10 до 70 кДа. Но встречаются и отдельные исключения: 2.5 кДа с коротким О-антигеном до 70 кДа с очень длинным О-антигеном. Клетки "теряют" эндотоксины в большом количестве во время своей гибели, а также в процессе роста и деления. Эндотоксины устойчивы к высоким температурам и не разрушаются при стандартных режимах автоклавирования. Эндотоксины можно разрушить только при использовании следующих режимов: 250 °С в течение 30 минут или 180 °С в течение более 3 часов. Применение кислот и щелочей с концентрацией не менее 0.1 М также может привести к разрушению эндотоксинов.

Методы удаления эндотоксинов

Существует целый ряд методов, которые применяют для удаления бактериальных эндотоксинов : ионообменная хроматография, аффинные сорбенты, гель-фильтрация, ультрафильтрация, центрифугирование в градиенте сахарозы, использование системы двухфазного разделения.

Способ удаления определяется масштабами и экономической целесообразностью. Для удаления эндотоксинов из больших объемов обычно используют ультрафильтрацию и ионообменную хроматографию. Ультрафильтрация очень эффективна для удаления эндотоксинов из воды и водных растворов, но совершенно не годится в случаях очистки от эндотоксинов растворов, содержащих белки или нуклеиновые кислоты. Те же недостатки ультрафильтрации относятся и к ионообменной хроматографии. Использование аффинных сорбентов, как правило, иммобилизованных на агарозе, сефарозе, акриламиде и других носителях, является, пожалуй, самым эффективным способом удаления бактериальных эндотоксинов. Основные минусы такого подхода: 1. длительность процесса удаления (необходимо многократно пропускать пробу через колонку, скорость протока при этом не может быть большой, т.к. это приводит к деформации сорбента), 2. разбавление пробы в процессе очистки может быть от 10 до 100-кратной, 3. стоимость аффинного сорбента может быть очень большой.

Двухфазная система разделения является самым дешевым и самым эффективным способом удаления эндотоксинов. Основной принцип этого метода - образование двухфазной мицеллярной системы за счет добавляемого в водный раствор мицеллообразующего полимера. Бактериальный эндотоксин захватывается образующимися мицеллами из водной гидрофильной части и при разделении фаз остается в гидрофобной среде (см. рис. 3).

Рисунок 3: Схема двухфазного мицеллярного разделения, вызванного повышением температуры.
Мицеллы могут присутствовать и в водной фазе, но их размер значительно меньше, чем в нижней гидрофобной части.

Использование трех циклов обработки двухфазной системой позволяет снизить уровень эндотоксинов во всех рекомбинантных белках, получаемых из E. coli, более чем на 99%. При этом биологическая активность и свойства самих белков не претерпевают изменений.
Минус двухфазной системы - в водной фазе после разделения всегда остается некоторое количество добавляемого мицеллообразующего полимера. Некоторые исследователи считают, что примеси этого полимера оказывают негативное влияние при дальнейшем использовании очищенных таким образом препаратов. Другие исследователи опровергают негативное такое негативное влияние. Наш опыт использования препаратов, очищенных от бактериальных эндотоксинов при помощи двухфазной мицеллярной системы, как в системе in vitro, так и in vivo, не показал никаких негативных эффектов ни на клетки, ни на животных, в которые вводили очищенные препараты.
По-видимому, работа с такой системой требует некоторых навыков и их недостаток может проявляться в последующих результатах.

Определение эндотоксинов

Для определения эндотоксинов стандартно применяют LAL тест (LAL: Limulus Amebocyte Lysate). С семидесятых годов этот тест вытеснил применявший ранее так называемый "пирогенный тест", когда испытуемый препарат вводили кроликам. Кролики очень чувствительны к эндотоксинам и их реакция на вводимые препараты долгое время служила индикатором пирогенности.
В настоящее время стал применяться также EAA тест (EAA: Endotoxin Activity Assay). Этот тест разработан компанией Spectral Diagnostics Inc. (www.spectraldx.com) и позволяет выявлять уровень эндотоксинов в крови.
По международной классификации концентрацию эндотоксинов обозначают в EU (endotoxin units): EU/мл или EU/мг. Одна единица (1 EU) приблизительно соответствует 100 пг эндотоксина. Одна бактериальная грам-негативная клетка содержит приблизительно 10-15г или 1 фг эндотоксина, таким образом, 1 EU производят 105 бактерий. 1 мл ночной культуры E. coli содержит от 5·108 до 109 клеток, что соответствует до 10"000 EU на 1 мл культуры.

Максимально допустимый уровень эндотоксина при внутривенном введении - 5 EU на кг тела в течение часа.

По материалам статьи ЗАО "Силекс". Реагенты для удаления эндотоксинов. www.sileks.com

Дерматовенерология , Национальное руководство , 2011, с.99-110

Кишечный эндотоксин и воспаление

М.Ю. Яковлев

Современный уровень научных знаний позволяет дать воспале­ нию следующее определение: «Воспаление - аварийный механизм иммунной защиты, направленный на распознавание, уничтожение и элиминацию чужеродных и собственных антигенов, носящий адаптивный и/или патогенный характер». Другими словами, вос­ паление - всегда деструктивный процесс, даже когда он жизненно необходим.

Междисциплинарное определение, сформулированное на III съезде Российского общества патологов, основано на учении И.И. Мечникова «О роли кишечного фактора в механизмах ста­ рения»; концепции Г. Селье «Общий адаптационный синдром» о первопричинности неспецифических факторов; «Клонально- селекционной теории иммунитета» Ф. Бернета и «Эндотоксиновой концепции физиологии и патологии человека».

Эти научные теории стимулировали клинические, молекуляр­ ные и генетические исследования, позволившие систематизировать ранее полученные данные о работе врожденного и адаптивного иммунитета, их взаимодействии между собой и инфекционными агентами. Знания об этом аспекте проблемы до недавнего времени были фрагментарными и не позволяли получить четких пред­ ставлений о механизмах регуляции иммунной системы кишечным эндотоксином на уровне целостного организма и участии общих «неспецифических» факторов в реализации и инициации воспа­ ления, поскольку без участия системного фактора невозможны и локальные его проявления.

Эндотоксин - термостабильный компонент наружной части клеточной мембраны всех грамотрицательных микроорганизмов, липополисахарид (ЛПС), состоящий из 3 частей: гидрофобного липида А - гликолипида Re -хемотипа , идентичного для эндоток­ синов всех грамотрицательных микроорганизмов; гидрофильного ядра и полисахарида, которые индивидуальны и позволяют вери­ фицировать грамотрицательные микроорганизмы с помощью серо­ логических методов исследования. Наличие гликолипида в моле­куле различных по происхождению ЛПС определяет общность их биологических свойств: пирогенного и противоопухолевого эффек­ тов, способности активировать дифференцировку клеток миелоцитарного ростка костного мозга и перекисное окисление липидов, стимулировать противовирусный и антибактериальный иммунитет,

индуцировать синдромы диссеминированного внутрисосудистого свертывания и полиорганной недостаточности.

Весь этот уникальный спектр биологической активности эндотоксинов до недавнего времени (до 1987-1988) рассматривали исключительно в формате сеп­ сиса и иных инфекционных заболеваний, в патогенезе которых предполагалась ведущая роль ЛПС экзогенных грамотрицательных бактерий. Участие кишечного эндотоксина в патогенезе «неинфекционной патологии», и тем более в физиологи­ческих процессах адаптации, не рассматривалось. Предполагалось, что в здоровом организме токсина (эндотоксина) не должно быть по определению. Такого же мне­ ния был и автор настоящей главы, пока при помощи высокоочищенных антител к Re -гликолипиду в мазках периферической крови практически здоровых пациентов не был обнаружен ЛПС, фиксированный на поверхности полиморфноядерных лейкоцитов.

Это позволило постулировать новое биологическое явление - системную эндотоксинемию и предположить важную роль кишечного ЛПС в регуляции активности иммунитета и инициации воспаления. Сначала были разработаны новые методы исследования, установлен диапазон нормативных («физиоло­гических») показателей концентрации эндотоксина в сыворотке и количества ЛПС-позитивных полиморфноядерных лейкоцитов в периферической крови условно здоровых волонтеров; затем установлен факт участия избытка ЛПС в патогенезе различных заболеваний, впоследствии названный «эндотоксиновой агрессией»; и, наконец, были идентифицированы рецепторы врожденного имму­ нитета - TLR 4, взаимодействующие с ЛПС и определяющие активность иммун­ ной системы. Таким образом, был верифицирован один из основных элементов ранее постулированной системной эндотоксинемии , определились молекулярные механизмы иммунорегулирующего действия кишечного ЛПС, реализуемого, как и предполагалась ранее, при непосредственном участии гипоталамо-гипофизарно- адреналовой системы. Стресс (физический, психоэмоциональный , иной этио­логии) обусловливает дополнительный сброс по портокавальным анастомозам «богатой» кишечным эндотоксином портальной крови, минуя печень, в общий кровоток. В состоянии относительного покоя, т.е. при отсутствии стрессорных воздействий, больше 95% портальной крови поступает в печень, где весь ЛПС элиминируется системой фиксированных макрофагов. Печень - наиболее «нуж дающийся» в эндотоксинах орган, поскольку при их взаимодействии с TLR 4 в макрофагах индуцируется синтез наиболее важных провоспалительных цитоки-нов , обеспечивающих базовый физиологический тонус противоопухолевого, анти­ бактериального и противовирусного иммунитета 1 . Не потребленный печенью ЛПС с желчью возвращается в кишечник, но, вероятнее всего, уже без полисахаридной части. Часть эндотоксина (меньше 5%) поступает с портальной кровью в общую гемоциркуляцию и поддерживает в состоянии физиологического тонуса все иммунокомпетентные органы (костный мозг, тимус и др.) и клетки (антигенпрезентирующие , полиморфноядерные лейкоциты, лимфоциты и др.). Таким образом, системная эндотоксинемия выполняет крайне важную функцию по обеспечению физиологического тонуса иммунной системы. При экстраординарных ситуациях (испуг, страх, оргазм, физическая нагрузка), всегда сопровождаемых стрессом, иммуностимулирующее действие эндотоксинемии усиливается, поскольку возрас­тает концентрация кишечного ЛПС в общем кровотоке. Очевидно, поэтому физио­ логические концентрации эндотоксинов колеблются в весьма широком диапазоне (от близкой к нулю до 1,0 EU / ml ) и имеют неуклонную тенденцию к увеличению с возрастом. В очень редких случаях ЛПС в сыворотке выявить не удается (вернее, его концентрация составляет меньше 0,0001 EU / ml ). Для этих пациентов харак­ терно значительное снижение основных показателей иммунного статуса. Однако существует также феномен эндотоксиновой толерантности - отсутствие харак­ терной пирогенной реакции при достаточно высоких (значительно превышающих верхнюю границу нормы) концентрациях эндотоксинов в крови. Для реализации биологических свойств эндотоксина (в частности, для взаимодействия ЛПС с TLR 4) необходимы липопротеины высокой плотности (ЛПВП) ЛПС-связывающий про­ теин (белок острой фазы, синтезируемый печенью), передающий эндотоксины рецептору CD 14, и некоторые другие белковые молекулы и кофакторы . Дефицит одного или нескольких вышеперечисленных факторов, большинство из которых синтезируется в печени, может служить причиной иммунодефицитных состояний, чаще всего возникающих при использовании противовоспалительных лекарствен­ных средств у больных с печеночной недостаточностью и пациентов с концентра­ цией ЛПС в общем кровотоке ниже 0,0001 EU / ml .

1 Н аверное, именно поэтому гнотобионтные животные практически беззащитны перед инфекция­ ми и значительно чаще подвержены онкологическим заболеваниям. «Безмикробные » животные лишены иммуностимулирующего эффекта кишечного ЛПС, так как не имеют грамотрицательной микрофлоры. (Примет, авт.)

Для более целостного понимания излагаемого материала мы сочли целесо­ образным кратко изложить основополагающие принципы работы иммунной системы и взаимодействия врожденного и адаптивного иммунитета.

Врожденный иммунитет обусловлен активностью нескольких сотен заро­ дышевых генов, обеспечивающих синтез соответствующего числа рецепторов. Именно они участвуют в борьбе с инфекцией в первые 3-5 сут (до формирования клонов лимфоцитов и нарабатывания пула специфических антител) за счет акти­вации комплемента, действия антимикробных пептидов и активности фагоцитов. Кроме того, врожденный иммунитет «организует» работу адаптивного, в частно­ сти, за счет взаимодействия ЛПС с TLR 4 2 и образования главных провоспалитель-ных цитокинов , обеспечивающих реализацию специфического иммунного ответа. Таким образом, эволюционно более древняя система врожденного иммунитета управляет более «молодой » адаптивной.

Адаптивный иммунитет во многом обеспечивается случайным процессом соматических мутаций лимфоцитов, в результате которых появляются рецепторы, способные распознать любой (даже синтетический) антиген, в том числе аутоантигены , антитела (AT ) к которым постоянно присутствуют в общем кровотоке. Количество таких рецепторов в физиологических условиях достигает астрономи­ ческих значений. Этот принцип организации адаптивного иммунитета позволяет обеспечить надежную систему защиты организма от инфекций и потенциально вредных мутаций, с одной стороны, а с другой - несет в себе большую опасность аутоиммунного повреждения. Принципиально важным представляется тот факт, что в регуляции данного процесса участвует врожденный иммунитет, активность которого, в свою очередь, во многом определяются концентрацией ЛПС в общем кровотоке.

Врожденный и адаптивный иммунитет работают в тандеме, что можно про­иллюстрировать на примере фагоцитов, которые также активируются кишечным эндотоксином. Самая многочисленная популяция иммунокомпетентных клеток находится на пике взаимодействия врожденного и адаптивного иммунитета в силу наличия на своей поверхности Fc -рецепторов, которые способны акцептировать

все AT , а значит специфически взаимодействовать с самыми различными анти­ генами, что позволяет характеризовать нейтрофил как фагоцит мультиспецифического действия, который ранее скрывался под термином «неспецифичность ».

В физиологических условиях 5-7% циркулирующих лейкоцитов несут на своей поверхности ЛПС, и приблизительно такое же количество фагоцитов способ­ ны связывать эндотоксины in vitro . При взаимодействии с ЛПС фагоцитарный потенциал нейтрофилов и их адгезивная активность возрастают. Они покидают сосудистое русло, а затем и организм (в составе экскретов: кала, мочи, пота и др.), выполняют защитную функцию «пограничников-камикадзе» в строме органов и тканей, непосредственно соприкасающихся с внешней средой.

Таким образом, системная эндотоксинемия (СЭЕ) - механизм регуля­ ции активности иммунитета кишечным ЛПС при непосредственном уча­ стии гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы. Стресс, являющийся атрибутом самой жизни, с одной стороны обеспечивает вброс в общий кровоток дополнительной порции универсального иммуностимулятора , а с другой - ниве­ лирует мощный провоспалительный эффект его избытка повышенным синтезом глюкокортикоидов (рис. 8-1). Этим достигается весьма нестабильное состояние под названием «сбалансированный иммунный статус», который в условиях доста­ точно продолжительного периода адаптации (длительного стресса) может быть нарушен. Увеличение концентрации кишечного ЛПС в общем кровотоке может превысить физиологически допустимые значения (они сугубо индивидуальны и имеют возрастные особенности) и служить единственной причиной инициации локальной воспалительной реакции (или ее обострения) и синдрома системного воспалительного ответа, с большей или меньшей выраженностью всегда сопро­вождающего воспаление (повышение температуры тела, концентрации белков острой фазы, СОЭ; лейкоцитоз и др.).а даптации организма к постоянно изменяющимся условиям внешней и внутренней среды принимает непосредственное участие в регуляции активности иммунитета и инициации воспаления, опосредованно - в увеличении концентрации кишечного эндотоксина в общем кровотоке. Таким образом, стресс может быть единственной причиной развития эндотоксиновой агрессии и, как следствие, - воспаления.

Рис. 8-1. Системная эндотоксинемия - сбалансированный иммунный статус .

Рис. 8-2. Эндотоксиновая агрессия как причина развития воспаления.

Эндотоксиновая агрессия - патологический процесс, обусловленный избыт­ ком ЛПС кишечного и/или иного происхождения в общем кровотоке, имеющий свои клинико-лабораторные проявления, является «предболезнью» или уни­ версальным общим фактором патогенеза заболеваний и синдромов, который манифестируется той или иной нозологической формой заболевания в силу кон­ ституциональной и/или приобретенной предрасположенности 3 . Этот универсаль­ ный эффект эндотоксиновой агрессии реализуется как минимум тремя путями: индукцией аутоиммунных реакций (в силу особенностей адаптивного иммуни­тета), формированием гиперергического иммунного фона и аутоагрессивностью лейкоцитов. Причины развития эндотоксиновой агрессии очень разнообразны: наиболее частая - стресс, а также любые патологические процессы, приводящие к повышению проницаемости кишечного барьера (пищевые отравления и острые кишечные инфекции, алкогольный эксцесс и дисбактериоз , непривычно жирная и острая пища, острые вирусные инфекции, шок и др.), портальная гипертензия и заболевания печени, хроническая и острая почечная недостаточность (поскольку именно почки служат основным ЛПС-выводящим органом). Наиболее наглядно механизм провоспалительного действия в весьма упрощенном виде (рис. 8-2) можно представить на примере длительного стресса (психоэмоциональная пере­грузка, депрессии, гипер - и гипотермия, запредельная физическая нагрузка и др.).

3 Введению этого термина предшествовали многолетние исследования многих отечественных и зарубежных ученых, среди которых создание доступных для клинической практики методов определения интегральных показателей концентрации ЛПС и активности антиэндотоксинового иммунитета, определение нормативных показателей. Именно поэтому в данной главе мы ограни­чимся лишь наиболее важными из них. (Примет, авт.)

Стрессиндуцированный провоспалительный эффект эндотоксинов в опреде­ ленной степени купируется противоположным действием глюкокортикоидов . Для синтеза этих гормонов используется холестерин, поступающий в корковый слой надпочечников исключительно в комплексе с липопротеинами высокой плотности (ЛПВП), сродство которых к ЛПС значительно выше, чем к холестерину. Именно поэтому избыток эндотоксинов обусловливает дефицит ЛПВП, который частично блокирует синтез глюкокортикоидов и приводит к усилению провоспалительного эффекта. В результате развивается гиперхолестеринемия и увеличивается «атеро-генный индекс», что долгие годы ошибочно считалось проявлением нарушения липидного обмена и основой развития атеросклероза. В настоящее время мало у кого возникают сомнения в отношении воспалительной природы атеросклероза, в частности роли «эндотелиальной дисфункции» в его инициации (эндотелиальная дисфункция, в свою очередь, индуцируется эндотоксиновой агрессией, что было предсказано еще в 1987 г.). Весьма убедительно эту концепцию подтверждает снижение концентрации «атерогенных » фракций липопротеинов (низкой и очень низкой плотности) при уменьшении уровня содержания ЛПС (<1,0 EU / ml ) в сыво­ ротке крови.

Выделяются в окружающую среду в процессе жизнедеятельности микроорганизма. Эндотоксины прочно связаны с бактериальной клеткой и выделяются в окружающую среду после гибели клетки.

Свойства эндо и экзотоксинов.

Экзотоксины образуют возбудители так называемых токсинемических инфекций, к которым относятся дифтерия , столбняк , газовая гангрена , ботулизм , некоторые формы стафилококковых и стрептококковых инфекций.

Некоторые бактерии одновременно образуют как экзо-,так и эндотоксины (кишечная палочка, холерный вибрион).

Получение экзотоксинов.

1) выращивание токсигенной (образующей экзотоксин) культуры в жидкой питательной среде;

2) фильтрование через бактериальные фильтры (отделение экзотоксина от бактериальных клеток); можно использовать другие способы очистки.

Экзотоксины используют затем для получения анатоксинов.

Получение анатоксинов.

1) к раствору экзотоксина (фильтрату бульонной культуры токсигенных бактерий) добавляют 0,4% формалин и выдерживают в термостате при 39-40°С 3-4 недели; происходит потеря токсичности, но антигенные и иммуногенные свойства сохраняются;

2) добавляют консервант и адъювант.

3) общая физиологическая реактивность организма; она определяется физиологическими особенностями макроорганизма, характером обмена веществ, функцией внутренних органов, эндокринных желез, особенностями иммунитета.

На общую физиологическую реактивность влияют :

а) пол и возраст : существуют детские инфекции (скарлатина, коклюш, корь, паротит), в преклонном возрасте тяжело протекает пневмония, во врем беременности женщины более чувствительны к стафилококковым и стрептококковым инфекциям, до 6 месяцев дети устойчивы к многим инфекциям, т.к. получают антитела от матери;

б) состояние нервной системы : угнетение нервной системы способствует более тяжелому течению инфекции; психические расстройства снижают регулирующую функцию ЦНС;

в) наличие соматических заболеваний (диабет, заболевания сердечно-сосудистой системы, печени, почек);

г) состояние нормальной микрофлоры , представители которой обладают антагонистическими свойствами;

д) питание : при недостаточном и неполноценном питании люди чаще подвержены инфекционным заболеваниям (туберкулез, дизентерия, холера), при этом наибольшее значение имеют белковые компоненты пищи, витамины и микроэлементы, так как они необходимы для синтеза антител и поддержания активного фагоцитоза; в результате голодания может быть утрачен не только индивидуальный, но и видовой иммунитет; недостаток витаминов приводит к нарушению обмена веществ, что снижает сопротивляемость к инфекциям;

е) иммунобиологические особенности организма, т.е. устойчивость естественных защитных факторов.

Эндотоксин или, если использовать более точный термин, бактериальный липополисахарид (ЛПС), считается самым мощным медиатором микробного происхождения, участвующим в патогенезе сепсиса и септического шока. Несмотря на то, что этот фактор был открыт более ста лет тому назад, основная роль эндотоксина, присутствующего в системном кровотоке большинства пациентов с септическим шоком, до сих пор не установлена и является предметом выраженной полемики. ЛПС - это наиболее существенная "сигнальная молекула", которая воспринимается системой раннего предупреждения естественного иммунитета хозяина, как предвестник внедрения грамотрицательных микроорганизмов во внутреннюю среду организма. Небольшие дозы ЛПС в ограниченном тканевом пространстве помогают организму хозяина организовать эффективную противомикробную защиту и удаление возбудителей во внешнюю среду. В то же время, внезапное высвобождение большого количества ЛПС, напротив, обладает пагубным влиянием на организм хозяина, поскольку в таком случае запускается неуправляемый и угрожающий жизни организма выброс многочисленных медиаторов воспаления и прокоагулянтов в системный кровоток. Выраженной реакции хозяина на эту молекулу, распознающую внедрение бактерий во внутреннюю среду организма, достаточно для того, чтобы вызвать диффузное повреждение эндотелия, гипоперфузию тканей, диссеминированное внутрисосудистое свертывание и рефрактерный шок. Многочисленные попытки блокировать активность эндотоксина, предпринятые в рамках клинических исследований, выполненных в популяции больных сепсисом, характеризуются противоречивыми и, главным образом, отрицательными результатами. Тем не менее, в течение предшествующего десятилетия были сделаны значительные открытия в области молекулярных основ ЛПС-опосредованной клеточной активации и тканевого повреждения, которые возродили оптимизм, связанный с возможным успехом применения терапии нового поколения, направленной на специфическое блокирование сигнальной системы ЛПС.

В настоящее время считается, что другие медиаторы микробного происхождения, которые
входят в структуру грамположительных бактерий, вирусов и грибов, также способны активировать многочисленные системы защиты организма хозяина, на которые воздействует ЛПС.

Эндотоксин распространяется в потоке крови и способствует активации моноцитов и макрофагов. В результате освобождаются медиаторы, в том числе цитокины, и создаются благоприятные условия для вызванного инфекцией системного воспаления. Эндотоксин является пусковым механизмом высвобождения цитокинов и медиаторов. Наличие эндотоксинов в крови называется эндотоксимией . При сильном иммунном ответе эндотоксемия может привести к септическому шоку . Считается, что воздействие на эндотоксин и его скорейшее выведение из организма являются важнейшими задачами при лечении сепсиса.

Термин «пироген» происходит от греческого “pyreto” – лихорадка. Пирогенами называют вещества, способные вызывать повышение температуры тела. Пирогенную реакцию способны вызывать вещества самой различной природы и разного происхождения. К пирогенам можно отнести грамотрицательные бактерии и их токсины, грамположительные бактерии и их токсины, вирусы и продукты их жизнедеятельности, а также стероиды и пр. В области контроля качества инъекционных лекарственных средств практическое значение имеют бактериальные эндотоксины, которые являются фрагментами внешней стенки грамотрицательных бактерий.

Грамотрицательные бактерии обладают двуслойной клеточной стенкой, которая окружает цитоплазматическую мембрану. Первый слой - очень тонкая (толщиной 1 нм) нелипидная мембрана, состоящая из пептидогликана. Его называют также гликопептидом или мукопептидом. Это сложный матрикс, содержащий полисахаридные цепи, связанные друг с другом поперечными сшивками из коротких пептидных цепей. Второй слой клеточной стенки - липидная мембрана толщиной 7,5 нм. Именно на этой внешней мембране и расположены эндотоксины (липополисахариды). Молекулы эндотоксина обеспечивают структурную целостность, отвечают за многие физиологические функции, в том числе определяют патогенные и антигенные свойства бактерий. Структурно молекула эндотоксина делится на три части – Липид А , Кор и О-специфическую цепь .


О-специфическая цепь Кор Липид А
Липид А состоит из дисахарида, фосфата и жирных кислот. Жирные кислоты, входящие в состав Липида А, могут быть насыщенными и ненасыщенными. Наиболее часто в состав Липида А входят кислоты: пальмитиновая, лауриновая, глутаминовая, меристиновая. Участок Липида А является наиболее константным участком молекулы ЛПС, и его строение схоже у многих бактерий.
О-специфическая цепь липополисахаридов построена из повторяющихся олигосахаридов. Наиболее распространенными сахарами, входящими в состав О-специфической цепи, являются глюкоза, галактоза, рамноза. Этот участок молекулы придает ей гидрофильные свойства, благодаря которым ЛПС хорошо растворимы в воде. Полисахаридная часть является наиболее вариабельной частью молекулы ЛПC. Часто этот фрагмент молекулы называют О-антигеном, так как именно он отвечает за антигенную активность грамотрицательных бактерий.
Кор - центральная часть молекулы, связывающая О-антиген с Липидом А. Формально структура кора подразделяется на внешнюю и внутреннюю части. В состав внутренней части кора обычно входят остатки L-глицеро-О-манногептозы и 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты (КДО). КДО содержит 8 атомов углерода и в природе практически нигде больше не встречается.
Кроме липополисахаридов в состав внешней стенки грамотрицательных бактерий входят и белки (внешняя мембрана на ¾ состоит из ЛПС, и только ¼ приходится на белковые компоненты). Эти белки вместе с ЛПС образуют белково-липополисахаридные комплексы разного размера и молекулярной массы. Именно эти комплексы и называются бактериальными эндотоксинами. Очищенные препараты, которые используются в качестве стандартов, лишены пептидных фрагментов и представляют собой чистый препарат липополисахарида. Тем не менее, термин «бактериальные эндотоксины» применяется с равным успехом и к естественным эндотоксинам, оказавшимся в растворе в результате разрушения бактерий, и к чистым препаратам ЛПС.
На внешней стенке одной грамотрицательной бактерии может содержаться до 3,5 млн. молекул ЛПС. После ее гибели все они оказываются в растворе. Эндотоксины грамотрицательных бактерий остаются биологически активными молекулами и после гибели бактерий. Молекула эндотоксина температуростабильна и легко выдерживает цикл стерилизации в автоклаве. Малые размеры молекул эндотоксинов позволяют им легко проходить через мембраны, используемые для стерилизации растворов (0,22 мкм). Поэтому эндотоксины могут присутствовать в готовых лекарственных формах, даже произведенных в асептических условиях и прошедших финишную стерилизацию.
Бактериальные эндотоксины являются исключительно активными (сильными) пирогенами. Для развития лихорадочного приступа достаточно присутствия бактериальных эндотоксинов в инфузионном растворе в концентрации 1 нг/мл (около 10 ЕЭ/мл). Другие пирогены менее активны, и для развития пирогенного ответа их концентрация должна быть в 100-1000 раз больше. Обычно термины «пирогены» и «эндотоксины» употребляются как синонимы и, хотя не все пирогены являются эндотоксинами, наиболее значимыми являются именно эндотоксины грамотрицательных бактерий.