В зависимости от локализации рецепторов в клетках–мишенях гормоны можно разделить на три группы.

Первую группу составляютгормоны липидной природы. Будучи жирорастворимыми, они легко проникают через клеточную мембрану и взаимодействуют с рецепторами, локализованными внутри клетки,–как правило, в цитоплазме.

Втораягруппа–белковые и пептидные гормоны. Они состоят из аминокислот и по сравнению с гормонами липидной природы имеют более высокую молекулярную массу и менее липофильны, из–за чего с трудом проходят через плазматическую мембрану. Рецепторы этих гормонов находятся на поверхности клеточной мембраны, так что белковые и пептидные гормоны в клетку не проникают.

Третью химическую группу гормонов составляют низкомолекулярныетиреоидные гормоны, образованные двумя аминокислотными остатками, связанными между собой эфирной связью. Эти гормоны легко проникают во все клетки тела и взаимодействуют с рецепторами, локализованными в ядре. Одна и та же клетка может иметь рецепторы всех трех типов, т.е. локализованные в ядре, цитозоле и на поверхности плазматической мембраны. Кроме того, в одной и той же клетке могут присутствовать разные рецепторы одного типа; например, на поверхности клеточной мембраны могут находиться рецепторы разных пептидных и/или белковых гормонов.

Вторичные посредники: 1)циклические нуклеотиды (цАМФ и цГМФ); 2)ионы Ca и 3)метаболиты фосфатидилинозитола.

Присоединение гормона к рецептору позволяет последнему взаимодействовать с G-белком. Если G-белок активирует систему аденилатциклаза-цАМФ, его называют Gs-белком. Стимуляция аденилатциклазы, связанной с мембраной фермента посредствам Gs-белка, катализирует превращение небольшого количества присутствующего в цитоплазме аденозинтрифосфата в цАМФ внутри клетки.

Следующий этап опосредован активацией цАМФ-зависимой протеинкиназой, которая фосфорилирует специфические белки в клетке, запуская биохимические реакции, что гарантированно обеспечивает ответ клетки на действие гормона.

Как только цАМФ образуется в клетке, это обеспечивает последовательную активацию ряда ферментов, т.е. каскадную реакцию. Таким образом, первый активированный фермент активирует второй, который активирует третий. Задача такого механизма заключается в том, что небольшое количество молекул, активированных аденилатциклазой, может активировать значительно большее количество молекул на следующем этапе каскадной реакции, что является способом усиления ответа.

В итоге благодаря этому механизму ничтожно малое количество гормона, действующее на поверхность мембраны клетки, запускает мощный каскад активирующих реакций.

Если гормон взаимодействует с рецептором , сопряженным с тормозящим G-белком (Gi-белок), это снижает образование цАМФ и, как следствие, снижает активность клетки.

Общие представления о путях сигнальной трансдукции

Для большинства регуляторных молекул между их связыванием с мембранным рецептором и окончательной реакцией клетки, т.е. изменением ее работы, вклиниваются сложные серии событий - определенные пути передачи сигнала, иначе называемые путями сигнальной трансдукции.

Регуляторные вещества принято подразделять на эндокринные, нейрокринные и паракринные. Эндокринные регуляторы (гормоны) выделяются эндокринными клетками в кровь и переносятся ею к клеткам-мишеням, которые могут находиться в любом месте организма. Нейрокринные регуляторы выделяются нейронами в непосредственной близости от клеток-мишеней. Паракринные вещества освобождаются несколько дальше от мишеней, но все же достаточно близко к ним, чтобы достичь рецепторов. Паракринные вещества секретируются одним типом клеток, а действуют на другой, однако в некоторых случаях регуляторы предназначены тем клеткам, которые их выделили, или соседним клеткам, относящимся к тому же типу. Это называется аутокринной регуляцией.

В ряде случаев последний этап сигнальной трансдукции состоит в фосфорилировании определенных эффекторных белков, что ведет к усилению или угнетению их активности, а это, в свою очередь, определяет необходимую организму клеточную реакцию. Фосфорилирование белков осуществляют протеинкиназы, а дефосфорилирование - протеинфосфатазы.

Изменения протеинкиназной активности происходят в результате связывания регуляторной молекулы (в общем случае называемой лигандом) с ее мембранным рецептором, что запускает каскады событий, некоторые из которых приведены на рисунке (рис. 2-1). Активность различных протеинкиназ регулируется рецептором не прямо, а через вторичные мессенджеры (вторичные посредники), в роли которых выступают, например, циклический АМФ (цAMФ), циклический ГМФ (цГMФ), Са 2+ , инозитол-1,4,5-три- фосфат (IP 3) и диацилглицерол (DAG). При этом связывание лиганда с мембранным рецептором изменяет внутриклеточный уровень вторичного мессенджера, что, в свою очередь, отражается на активности протеинкиназы. Многие регулятор-

ные молекулы влияют на клеточные процессы через пути сигнальной трансдукции с участием гетеротримерных ГТФ-связывающих белков (гетеротримерных G-белков) или мономерных ГТФ-связывающих белков (мономерных G-белков).

Когда молекулы лиганда связываются с мембранными рецепторами, взаимодействующими с гетеротримерными G-белками, происходит переход G-белка в активное состояние путем связывания с ГТФ. Активированный G-белок может затем взаимодействовать со многими эффекторными белками, прежде всего ферментами, такими, как аденилатциклаза, фосфодиэстераза, фосфолипазы С, А 2 и D. Это взаимодействие запускает цепи реакций (рис. 2-1), которые заканчиваются активацией различных протеинкиназ, таких, как протеинкиназа А (ПКА), протеинкиназа G (ПKG), протеинкиназа C (ПИС).

В общих чертах пути сигнальной трансдукции с участием G-белков - протеинкиназ включает следующие этапы.

1.Лиганд связывается с рецептором на мембране клетки.

2.Связанный с лигандом рецептор, взаимодействуя с G-белком, активирует его, и активированный G-белок связывает ГТФ.

3.Активированный G-белок взаимодействует с одним или несколькими следующими соединениями: аденилатциклазой, фосфодиэстеразой, фосфолипазами С, А 2 , D, активируея или ингибируя их.

4.Внутриклеточный уровень одного или нескольких вторичных мессенджеров, таких, как цАМФ, цГМФ, Са 2+ , IP 3 или DAG, возрастает или снижается.

5.Увеличение или уменьшение концентрации вторичного мессенджера влияет на активность одной или нескольких зависимых от него протеинкиназ, таких, как цАМФ-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа А), цГМФ-зависимая протеинкиназа (ПКG), кальмодулинзависимая протеинкиназа (КМПК), протеинкиназа С. Изменение концентрации вторичного мессенджера может активировать тот или иной ионный канал.

6.Уровень фосфорилирования фермента или ионного канала изменяется, что влияет на активность ионного канала, обуславливая конечный ответ клетки.

Рис. 2-1. Некоторые каскады событий, реализующиеся в клетке благодаря вторичным посредникам.

Обозначения: * - активированный фермент

Мембранные рецепторы, связанные с G-белками

Мембранные рецепторы, опосредующие агонист-зависимую активацию G-белков, составляют особое семейство белков, в котором 500 с лишним представителей. К нему относятся α- и β-адренергические, мускариновые ацетилхолиновые, серотониновые, аденозиновые, обонятельные рецепторы, родопсин, а также рецепторы большинства пептидных гормонов. Представители семейства рецепторов, связанных с G-белками, имеют семь трансмембранных α-спиралей (рис. 2-2 А), каждая из которых содержит 22-28 преимущественно гидрофобных аминокислотных остатков.

Для некоторых лигандов, например, ацетилхолина, адреналина, норадреналина и серотонина, известны разные подтипы связанных с G-белками рецепторов. Зачастую они различаются сродством к конкурентным агонистам и антагонистам.

Далее представлена (рис. 2-2 Б) молекулярная организация аденилатциклазы - фермента, продуцирующего цАМФ (первый открытый вторичный мессенджер). Регуляторный путь аденилатциклазы считается классическим путем сигнальной трансдукции, обусловленной G-белками.

Аденилатциклаза служит основой позитивного или негативного контроля путей сигнальной трансдукции через G-белки. При позитивном контроле связывание стимулирующего лиганда, например, адреналина, действующего через β-адренергические рецепторы, ведет к активации гетеротримерных G-белков с α-субъединицей типа as («s» означает стимуляцию). Активация Gs-типа G-белков посредством связанного с лигандом рецептора приводит к тому, что его as-субъединица связывает ГТФ, и затем диссоциирует от βγ-димера.

На рисунке 2-2 В показано, как фосфолипаза С расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат на инозитол-1,4,5-трифосфат и диацилглицерол. Оба вещества, инозитол-1,4,5-трифосфат и диацилглицерол, относятся к вторичным мессенджерам. IP3, связываясь со специфическими лигандзависимыми Са 2+ -каналами эндоплазматического ретикулума, высвобождает из него Са 2+ , т.е. повышает концентрацию Са 2+ в цитозоле. Диацилглицерол вместе с Са 2+ активирует другой важный класс протеинкиназ - протеинкиназу С.

Затем показана структура некоторых вторичных мессенджеров (рис. 2-2 Г-Е): цАМФ, ГМФ,

цГМФ.

Рис. 2-2. Примеры молекулярной организации некоторых структур, участвующих в путях сигнальной трансдукции.

А - рецептор мембраны клетки, связывающий на внешней поверхности лиганд, а внутри - гетеротримерный G-белок. Б - молекулярная организация аденилатциклазы. В - структура фосфатидилинози- тол-4,5-дифосфата и образованных под действием фосфолипазы С инозитол-1,4,5-трифосфата и диацилглицерола. Г - структура 3",5"-циклического АМФ (активатора протеинкиназы А). Д - структура ГМФ. Е - структура 3",5"-циклического ГМФ (активатора протеинкиназы G)

Гетеротримерные G-белки

Гетеротримерный G-белок состоит из трех субъединиц: α (40 000-45 000 Да), β (около 37 000 Да) и γ (8000-10 000 Да). Сейчас известно около 20 различных генов, кодирующих эти субъединицы, в том числе не менее четырех генов β-субъединиц и примерно семь генов γ-субъединиц млекопитающих. Функция и специфичность G-белка обычно, хотя и не всегда, определяются его α-субъединицей. У большинства G-бел- ков субъединицы β и γ плотно связаны между собой. Некоторые гетеротримерные G-белки и пути трансдукции, в которых они задействованы, перечислены в табл. 2-1.

Гетеротримерные G-белки служат посредниками между рецепторами плазматической мембраны для более 100 внеклеточных регуляторных веществ и внутриклеточными процессами, которые они контролируют. В общих чертах, связывание регуляторного вещества с его рецептором активирует G-белок, а тот либо активирует, либо ингибирует фермент и/или вызывает цепь событий, приводящих к активации определенных ионных каналов.

На рис. 2-3 представлен общий принцип работы гетеротримерных G-белков. В большинстве G-белков α-субъединица представляет собой «рабочий элемент» гетеротримерных G-белков. Активация большинства G-белков приводит к конформационному изменению этой субъединицы. Неактивные G-белки существуют главным образом в форме αβγ-гетеротримеров,

с ГДФ в позициях, связывающих нуклеотид. Взаимодействие гетеротримерных G-белков с присоединившим лиганд рецептором ведет к преобразованию α-субъединицы в активную форму с повышенным сродством к ГТФ и пониженной афинностью его к βγ-комплексу. В результате активированная α-субъединица освобождает ГДФ, присоединяет ГТФ, а затем диссоциирует от βγ-димера. У большинства G-белков диссоциированная α-субъединица затем взаимодействует с эффекторными белками в пути сигнальной трансдукции. Однако у некоторых G-белков освободившийся βγ-димер может быть ответственным за все или некоторые эффекты рецептор-лигандного комплекса.

Работа некоторых ионных каналов модулируется G-белками непосредственно, т.е. без участия вторичных мессенджеров. Например, связывание ацетилхолина с мускариновыми М 2 -рецепторами сердца и некоторых нейронов ведет к активации особого класса К + -каналов. В этом случае связывание ацетилхолина с мускариновым рецептором ведет к активации G-белка. Его активированная α-субъединица затем отделяется от βγ-димера, а βγ-димер напрямую взаимодействует с особым классом К + -каналов, приводя их в открытое состояние. Связывание ацетилхолина с мускариновыми рецепторами, повышающее К+-проводимость пейсмекерных клеток в синоатриальном узле сердца - один из главных механизмов, посредством которого парасимпатические нервы вызывают уменьшение частоты сердечных сокращений.

Рис. 2-3. Принцип работы гетеротримерных ГТФ-связывающих белков (гетеротримерных G-белков).

Таблица 2-1. Некоторые гетеротримерные ГТФ-связывающие белки млекопитающих, классифицированные на основе их α-субъединиц *

* В каждом классе α-субъединиц различают несколько изоформ. Идентифицировано более 20 α-субъединиц.

Мономерные G-белки

Клетки содержат еще одно семейство ГТФсвязывающих белков, которые называют мономерными ГТФ-связывающими белками. Они также известны как G-белки с низкой молекулярной массой или малые G-белки (молекулярная масса 20 000-35 000 Да). В таблице 2-2 перечислены основные подклассы мономерных ГТФсвязывающих белков и некоторые из их свойств. Ras-подобные и Rho-подобные мономерные ГТФ-связывающие белки участвуют в пути сигнальной трансдукции на этапе передачи сигнала от тирозинкиназы, рецептора фактора роста, на внутриклеточные эффекторы. Среди процессов, регулируемых путями сигнальной трансдукции, в которые вовлечены мономерные ГТФсвязывающие белки, можно назвать элонгацию полипептидной цепи в ходе белкового синтеза, пролиферацию и дифференцировку клеток, их злокачественное перерождение, контроль актинового цитоскелета, связь между цитоскелетом

и внеклеточным матриксом, транспорт везикул между различными органеллами и экзоцитозную секрецию.

Мономерные ГТФ-связывающие белки, как и их гетеротримерные аналоги, представляют собой молекулярные переключатели, существующие в двух формах - активированной «включенной» и инактивированной «выключенной» (рис. 2-4 Б). Однако активация и инактивация мономерных ГТФ-связывающих белков требует дополнительных регуляторных белков, которые, насколько известно, не требуются для работы гетеротримерных G-белков. Мономерные G-белки активируются гуанин-нуклеотид-освобождающими белками, а инактивируются ГТФаза-активирующими белками. Таким образом, активация и инактивация мономерных ГТФ-связывающих белков контролируется сигналами, которые изменяют активность гуанин-нуклеотид-освобождающих белков или ГТФаза-активирующих белков скорее, чем путем прямого воздействия на мономерные G-белки.

Рис. 2-4. Принцип работы мономерных ГТФ-связывающих белков (мономерных G-белков).

Таблица 2-2. Подсемейства мономерных ГТФ-связывающих белков и некоторые регулируемые ими внутриклеточные процессы

Механизм работы гетеротримерных G-белков

Неактивные G-белки существуют главным образом в форме αβγ-гетеротримеров, с ГДФ в их позициях, связывающих нуклеотид (рис. 2-5 А). Взаимодействие гетеротримерных G-белков с присоединившим лиганд рецептором ведет к преобразованию α-субъединицы в активную форму, которая имеет повышенное сродством к ГТФ и пониженную афинность его к βγ-комплексу (рис. 2-5 Б). В большинстве гетеротримерных G-белков именно α-субъединица представляет собой структуру, передающую информацию. Активация большинства G-белков приводит к конформационному изменению α-субъединицы.

В результате активированная α-субъединица освобождает ГДФ, присоединяет ГТФ (рис. 2-5 В), а затем диссоциирует от βγ-димера (рис. 2-5 Г). У большинства G-белков диссоциированная α-субъединица сразу взаимодействует с эффекторными белками (Е 1) в пути сигнальной трансдукции (рис. 2-5 Г). Однако у некоторых G-белков освободившийся βγ-димер может быть ответственным за все или за некоторые эффекты рецептор-лигандного комплекса. Затем βγ-димер взаимодействует с эффекторным белком Е 2 (рис. 2-5 Д). Далее показано, что члены RGS семьи G-белка стимулируют гидролиз ГТФ (рис. 2-5 Е). Это инактивирует α-субъединицу и объединяет все субъединицы в αβγ-гетеротример.

Рис. 2-5. Цикл работы гетеротримерного G-белка, запускающего дальнейшую цепь событий с помощью своей α -субъединицы.

Обозначения: R - рецептор, L - лиганд, Е - эффекторный белок

Пути сигнальной трансдукции через гетеротримерные G-белки

На рисунке 2-6 А показаны три лиганда, их рецепторы, связанные с разными G-белками, и их молекулярные мишени. Аденилатциклаза является основой для позитивного или негативного контроля путей сигнальной трансдукции, которые обусловлены G-белками. При позитивном контроле связывание стимулирующего лиганда, например норадреналина, действующего через β- адренергические рецепторы, ведет к активации гетеротримерных G-белков с α-субъединицей типа α S («s» означает стимуляцию). Поэтому такой G-белок называют G-белком G S -типа. Активация G s -типа G-белков посредством связанного с лигандом рецептора приводит к тому, что его α s - субъединица связывает ГТФ и затем диссоциирует от βγ-димера.

Другие регуляторные вещества, такие, как адреналин, действующий через α 2 -рецепторы, или аденозин, действующий через α 1 -рецепторы, или дофамин, действующий через D 2 -рецепторы, участвуют в негативном или ингибирующем контроле аденилатциклазы. Эти регуляторные вещества активируют G i -тип G-белков, которые имеют α-субъединицу типа α i («i» означает ингибирование). Связывание ингибирующего лиганда с его

рецептором активирует G i -тип G-белков и вызывает диссоциацию его α i -субъединицы от βγ-димера. Активированная α i -субъединица связывается с аденилатциклазой и подавляет ее активность. Кроме того, βγ-димеры могут связывать свободные α s -субъединицы. Этим путем связывание βγ-димеров со свободной α s -субъединицей дополнительно подавляет стимуляцию аденилатциклазы, блокируя действие стимулирующих лигандов.

Еще один класс внеклеточных агонистов (рис. 2-6 А) связывается с рецепторами, которые активируют посредством G-белка, называемого G q , β-изоформу фосфолипазы С. Она расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат (фосфолипид, в малых количествах присутствующий в плазматической мембране) на инозитол-1,4,5- трифосфат и диацилглицерол, которые относятся ко вторичным мессенджерам. IP 3 , связываясь со специфичными лигандзависимыми Са 2+ -каналами эндоплазматического ретикулума, высвобождает из него Са 2+ , т.е. повышает концентрацию Са 2+ в цитозоле. Са 2+ -каналы эндоплазматического ретикулума вовлечены в электромеханическое сопряжение в скелетной и сердечной мышце. Диацилглицерол вместе с Са 2+ активирует протеинкиназу С. К ее субстратам относятся, например, белки, участвующие в регуляции клеточного деления.

Рис. 2-6. Примеры путей сигнальной трансдукции через гетеротримерные G-белки.

А - в трех приведенных примерах связывание нейротрансмиттера с рецептором ведет к активации G-белка и последующему включению путей вторичных мессенджеров. G s , G q , и G i подразумевают три различных типа гетеротримерных G-белков. Б - регуляция клеточных белков фосфорилированием ведет к усилению или угнетению их активности, а это, в свою очередь, определяет необходимую организму клеточную реакцию. Фосфорилирование белков осуществляют протеинкиназы, а дефосфорилирование - протеинфосфатазы. Протеинкиназа переносит фосфатную группу (Pi) от АТФ на сериновые, треониновые или тирозиновые остатки белков. Это фосфорилирование обратимо меняет структуру и функции клеточных белков. Оба типа ферментов - киназы и фосфатазы - регулируются различными внутриклеточными вторичными мессенджерами

Пути активации внутриклеточных протеинкиназ

Взаимодействие гетеротримерных G-белков с присоединившим лиганд рецептором ведет к преобразованию α-субъединицы в активную форму, которая имеет повышенное сродство к ГТФ и пониженную афинность его к βγ-комплексу. Активация большинства G-белков приводит к конформационному изменению α-субъединицы, которая освобождает ГДФ, присоединяет ГТФ, а затем диссоциирует от βγ-димера. Далее диссоциированная α-субъединица взаимодействует с эффекторными белками в пути сигнальной трансдукции.

На рисунке 2-7 А продемонстрирована активация гетеротримерных G-белков G s -типа с α-субъединицей типа α s , которая происходит благодаря связыванию с лигандом рецептора и приводит к тому, что α s -субъединица G-белков G s -типа связывает ГТФ и затем диссоциирует от βγ-димера, а далее взаимодействует с аденилатциклазой. Это приводит к повышению уровня цАМФ и активации ПКА.

На рисунке 2-7 Б продемонстрирована активация гетеротримерных G-белков G t -типа с α-субъединицей типа α t , которая происходит благодаря связыванию с лигандом рецептора и приводит к тому, что α t -субъединица G-белков G t -типа активируется и затем диссоциирует от βγ-димера, а далее взаимодействует с фосфодиэстеразой. Это приводит к повышению уровня цГМФ и активации ПKG.

Рецептор катехоламинов α 1 взаимодействует с G αq -субъединицей, активирующей фосфолипазу С. На рисунке 2-7 В продемонстрирована активация гетеротримерных G-белков G αq -типа с α-субъединицей типа α q , которая происходит благодаря связыванию лиганда с рецептором и приводит к тому, что α q -субъединица G-белков G αq -типа активируется и затем диссоциирует от βγ-димера, а далее взаимодействует с фосфолипазой С. Она расщепляет фосфатидилинози- тол-4,5-дифосфат на IP 3 и DAG. Это приводит к повышению уровня IP 3 и DAG. IP 3 , связываясь со специфичными лигандзависимыми Са 2+ - каналами эндоплазматического ретикулума,

высвобождает из него Са 2+ . DAG вызывает активацию протеинкиназы С. В нестимулированной клетке значительное количество этого фермента находится в цитозоле в неактивной форме. Са 2+ заставляет протеинкиназу С связываться с внутренней поверхностью плазматической мембраны. Здесь фермент может активироваться диацилглицеролом, который образуется при гидролизе фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата. Мембранный фосфатидилсерин также может быть активатором протеинкиназы С, если фермент находится в мембране.

Описано около 10 изоформ протеинкиназы С. Хотя некоторые из них присутствуют во многих клетках млекопитающих, однако подтипы γ и ε обнаружены, главным образом, в клетках центральной нервной системы. Подтипы протеинкиназы С различаются не только распределением по организму, но, по-видимому, и механизмами регуляции своей активности. Некоторые из них в нестимулированных клетках связаны с плазматической мембраной, т.е. не требуют для активации увеличения концентрации Са 2+ . Некоторые изоформы протеинкиназы С активируются арахидоновой кислотой или другими ненасыщенными жирными кислотами.

Первоначальная кратковременная активация протеинкиназы С происходит под действием диацилглицерола, который освобождается, когда фосфолипаза С β активируется, а также под влиянием Са 2+ , освобожденного из внутриклеточных хранилищ с помощью IP 3 . Долго длящаяся активация протеинкиназы С запускается рецептор-зависимыми фосфолипазами А 2 и D. Они действуют первично на фосфатидилхолин - основной мембранный фосфолипид. Фосфолипаза А 2 отделяет от него жирную кислоту во втором положении (обычно ненасыщенную) и лизофосфатидилхолин. Оба эти продукта активируют определенные изоформы протеинкиназы С. Рецептор-зависимая фосфолипаза D расщепляет фосфатидилхолин таким образом, что образуется фосфатидная кислота и холин. Фосфатидная кислота далее расщепляется до диацилглицерола, участвующего в долговременной стимуляции протеинкиназы С.

Рис. 2-7. Основные принципы активации протеинкиназы А, протеинкиназы G и протеинкиназы С.

Обозначения: R - рецептор, L - лиганд

цAMФ-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа А) и связанные с ней сигнальные пути

В отсутствии цАМФ, цАМФ-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа А) состоят из четырех субъединиц: двух регуляторных и двух каталитических. У большинства типов клеток каталитическая субъединица одна и та же, а регуляторные субъединицы высокоспецифичны. Присутствие регуляторных субъединиц почти полностью подавляет ферментативную активность комплекса. Таким образом, активация ферментативной активности цАМФ-зависимой протеинкиназы должна вовлекать отделение регуляторных субъединиц от комплекса.

Активация происходит в присутствии микромолярных концентраций цАМФ. Каждая регуляторная субъединица связывает две его молекулы. Связывание цАМФ индуцирует конформационные изменения в регуляторных субъединицах и снижает аффинность их взаимодействия с каталитическими субъединицами. В результате этого регуляторные субъединицы отделяются от каталитических, и каталитические субъединицы становятся активированными. Активная каталитическая субъединица фосфорилирует белкимишени по определенным сериновым и треониновым остаткам.

Сравнение аминокислотных последовательностей цАМФ-зависимой и других классов протеинкиназ показывает, что, несмотря на сильные различия в их регуляторных свойствах, все эти ферменты высокогомологичны по первичной структуре срединной части. Эта часть содержит АТФ-связывающий домен и активный центр фермента, обеспечивающий перенос фосфата с АТФ на белок-акцептор. Участки киназ за пределами этой каталитической срединной части белка участвуют в регуляции киназной активности.

Определена также кристаллическая структура каталитической субъединицы цАМФ-зависимой протеинкиназы. Каталитическая средняя часть молекулы, имеющаяся у всех известных протеинкиназ, состоит из двух долей. Меньшая из них содержит необычный АТФ-связывающий участок, а большая доля содержит участок связывания пептида. Многие протеинкиназы содержат также регуляторный участок, известный как псевдосубстратный домен. По аминокислотной последовательности он напоминает фосфорилируемые участки субстратных белков. Псевдосубстратный домен, связываясь с активным центром протеинкиназы, ингибирует фосфорилирование истинных субстратов протеинкиназы. Активация киназы может включать фосфорилирование или нековалентную аллостерическую модификацию протеинкиназы для устранения ингибирующего действия псевдосубстратного домена.

Рис. 2-8. цAMФ-зависимая протеинкиназа А и мишени.

Когда адреналин связывается с соответствующим рецептором, активация α s -субъединицы стимулирует аденилатциклазу с увеличением уровня цАМФ. цАМФ активирует протеинкиназу А, которая путем фосфорилирования дает три основных эффекта. (1) Протеинкиназа А активирует киназу фосфорилазы гликогена, которая фосфорилирует и активирует фосфорилазу гликогена. (2) Протеинкиназа А инактивирует гликогенсинтазу и таким образом уменьшает образование гликогена. (3) Протеинкиназа А активирует ингибитор фосфопротеин-фосфатазы-1 и тем самым ингибирует фосфатазу. Эффект в целом заключается в координации изменений уровня глюкозы.

Обозначения: УДФ-глюкоза - уридиндифосфатглюкоза

Гормональная регуляция активности аденилатциклазы

На рисунке 2-9 А представлен принципиальный механизм индуцированной гормонами стимуляции и ингибирования аденилатциклазы. Взаимодействие лиганда с рецептором, связанным с α-субъединицей типа α s (стимулирующая), вызывает активацию аденилатциклазы, тогда как взаимодействие лиганда с рецептором), связанным с α-субъединицей типа α i (ингибирующая), вызывает ингибирование фермента. G βγ -субъединица и в стимулирующих, и в ингибирующих G-белках идентична. G α -субъединицы и рецепторы различны. Лиганд-стимулирован-ное образование активных G α ГТФ комплексов происходит с помощью одинаковых механизмов в обоих G αs ,- и G αi -протеинах. Однако G αs ГТФ и G αi ГТФ по-разному взаимодействуют с аденилатциклазой. Одна (G αs ГТФ) стимулирует, а другая G αi ГТФ) ингибирует ее каталитическую активность.

На рисунке 2-9 Б представлен механизм индуцированной определенными гормонами активации и ингибирования аденилатциклазы. β 1 -, β 2 - и D 1 -рецепторы взаимодействуют с субъединицами, которые активируют аденилатциклазу и повышают уровень цАМФ. α 2 -и D 2 -рецепторы взаимодействуют с G αi субъединицами, которые ингибируют аденилатциклазу. (Что касается α 1 -рецептора, то он взаимодействует с G -субъединицей, которая активирует фосфолипазу С.) Рассмотрим один из примеров, представленных на рисунке. Адреналин связывается с β 1 -рецептором, что приводит к активации G αs -белка, который стимулирует аденилатциклазу. Это приводит к увеличению внутриклеточного уровня цАМФ, и, таким образом, усиливает активность ПКА. С другой стороны, норадреналин связывается с α 2 -рецептором, что приводит к активации G αi -белка, который ингибирует аденилатциклазу и тем самым снижает внутриклеточный уровень цАМФ, уменьшая активность ПКА.

Рис. 2-9. Индуцированная лигандами (гормонами) активация и ингибирование аденилатциклазы.

А - принципиальный механизм. Б - механизм применительно к конкретным гормонам

Протеинкиназа С и связанные с ней сигнальные пути

Рецептор α 1 взаимодействует с G αq -субъединицей G-белка, которая активирует фосфолипазу С. Фосфолипаза С расщепляет фосфатидилинози- тол-4,5-дифосфат на IP 3 и DAG. IP 3 , связываясь со специфичными лиганд-зависимыми Са 2+ -каналами эндоплазматического ретикулума, высвобождает из него Са 2+ , т.е. повышает концентрацию Са 2+ в цитозоле. DAG вызывает активацию протеинкиназы С. В нестимулированной клетке этот фермент находится в цитозоле в неактивной

форме. Если цитозольный уровень Са 2+ повышается, происходит взаимодействие Са 2+ с протеинкиназой С, что приводит к связыванию протеинкиназы С с внутренней поверхностью клеточной мембраны. В таком положении фермент активируется диацилглицеролом, образующимся при гидролизе фосфатидилинозитол-4,5-дифосфа- та. Мембранный фосфатидилсерин также может быть активатором протеинкиназы С, если фермент находится в мембране.

В таблице 2-3 приведены изоформы протеинкиназы С млекопитающих и свойства этих изоформ.

Таблица 2-3. Свойства изоформ протеинкиназы С млекопитающих

ДАГ - диацилглицерол; ФС - фосфатидилсерин; ФФА - цис-ненасыщенные жирные кислоты; ЛФХ - лизофосфатидилхолин.

Рис. 2-10. Сигнальные пути диацилглицерол / инозитол-1,4,5-трифосфат

Фосфолипазы и связанные с ними сигнальные пути на примере арахидоновой кислоты

Некоторые агонисты посредством G-белков активируют фосфолипазу А 2 , которая действует на мембранные фосфолипиды. Продукты их реакций могут активировать протеинкиназу С. В частности, фосфолипаза A 2 отделяет от фосфолипидов находящуюся во втором положении жирную кислоту. Вследствие того, что некоторые фосфолипиды содержат в этом положении арахидоновую кислоту, вызванное фосфолипазой A 2 , расщепление этих фосфолипидов освобождает значительное ее количество.

Вышеописанный сигнальный путь арахидоновой кислоты, связанный с фосфолипазой А 2 , называют прямым. Непрямой путь активации арахидоновой кислоты связан с фосфолипазой С β .

Арахидоновая кислота сама по себе является эффекторной молекулой, а кроме того, служит предшественником для внутриклеточного синтеза простагландинов, простациклинов, тромбоксанов и лейкотриенов - важных классов регуляторных молекул. Арахидоновая кислота также образуется из продуктов расщепления диацил-глицеролов.

Простагландины, простациклины и тромбоксаны синтезируются из арахидоновой кислоты циклооксигеназно-зависимым путем, а лейкотриены - липоксигеназно-зависимым путем. Один из противовоспалительных эффектов глюкокортикоидов заключается как раз в ингибировании фосфолипазы A 2 , которая освобождает арахидоновую кислоту из фосфолипидов. Ацетилсалициловая кислота (аспирин  ) и другие нестероидные противовоспалительные средства ингибируют окисление арахидоновой кислоты циклооксигеназой.

Рис. 2-11. Сигнальные пути арахидоновой кислоты.

Обозначения: ПГ - простагландин, ЛГ - лейкотриен, ГПЭТЕ - гидропероксиэйкозатетраеноат, ГЭТЕ - гидроксиэйкозатетраеноат, ЭПР - эндоплазматический ретикулум

Кальмодулин: строение и функции

Множество жизненно важных клеточных процессов, включая освобождение нейротрансмиттеров, секрецию гормонов и мышечное сокращение, регулируется цитозольным уровнем Са 2+ . Один из путей влияния этого иона на клеточные процессы заключается в его связывании с кальмодулином.

Кальмодулин - белок с молекулярным весом 16 700 (рис. 2-12 А). Он присутствует во всех клетках, иногда составляя до 1% их общего белкового содержимого. Кальмодулин связывает четыре иона кальция (рис. 2-12 Б и В), после чего этот комплекс регулирует активность различных внутриклеточных белков, многие из которых не относятся к протеинкиназам.

Комплекс Са 2+ c кальмодулином активирует также кальмодулин-зависимые протеинкиназы. Специфический кальмодулин-зависимые протеинкиназы фосфорилируют специфические эффекторные белки, например, регуляторные легкие цепи миозина, фосфорилазу и фактор элонгации II. Мультифункциональные кальмодулин-зависимые протеинкиназы фосфорилируют многочисленные белки ядра, цитоскелета или мембранные белки. Некоторые кальмодулинзависимые протеинкиназы, такие, как киназа

легкой миозиновой цепи и киназа фосфорилазы, действуют только на один клеточный субстрат, тогда как другие полифункциональны и фосфорилируют более чем один субстратный белок.

Кальмодулин-зависимая протеинкиназа II относится к мажорным белкам нервной системы. В некоторых областях головного мозга на нее приходится до 2% общего белка. Эта киназа участвует в механизме, при котором увеличение концентрации Са 2+ в нервном окончании вызывает освобождение нейротрансмиттера по типу экзоцитоза. Ее главным субстратом служит белок под названием синапсин I, присутствующий в нервных окончаниях и связывающийся с наружной поверхностью синаптических везикул. Когда синапсин I связан с везикулами, он предотвращает экзоцитоз. Фосфорилирование синапсина I вызывает его отделение от везикул, позволяя им выбросить нейротрансмиттер в синаптическую щель путем экзоцитоза.

Киназа легких цепей миозина играет важную роль в регуляции сокращения гладких мышц. Повышение цитозольной концентрации Са 2+ в клетках гладких мышц активирует киназу легких цепей миозина. Фосфорилирование регуляторных легких цепей миозина приводит к длительному сокращению гладкомышечных клеток.

Рис. 2-12. Кальмодулин.

А - кальмодулин без кальция. Б - связывание кальция с кальмодулином и пептидной мишенью. В - схема связывания.

Обозначения: EF - Са 2+ -связывающие домены кальмодулина

Рецепторы с собственной ферметативной активностью (каталитические рецепторы)

Гормоны и факторы роста связываются с протеинами поверхности клетки, которые имеют ферментативную активность на цитоплазматической стороне мембраны. На рисунке 2-13 представлены пять классов каталитических рецепторов.

Один из характерных экземпляров трансмембранных рецепторов с гуанилатциклазной активностью, рецептор предсердного натрий-уретического пептида (ANP). Мембранный рецептор, с которым связывается ANP, не зависит от рассмотренных систем сигнальной трансдукции. Выше было описано действие внеклеточных агонистов, которые, связываясь с мембранными рецепторами, либо активируют аденилатциклазу через G s -белки, либо угнетают ее через G i . Мембранные рецепторы для ANP интересны тем, что сами рецепторы обладают гуанилатциклазной активностью, стимулирующейся связыванием ANP с рецептором.

ANP-рецепторы имеют внеклеточный ANP-свя- зывающий домен, единственную трансмембранную спираль и внутриклеточный гуанилатциклазный домен. Связывание ANP с рецептором повышает внутриклеточный уровень цГМФ, что стимулирует цГМФ-зависимую протеинкиназу. В противоположность цАМФ-зависимой протеинкиназе, имеющей регуляторную и каталитическую субъединицы, регуляторные и каталитические домены цГМФ-зависимой протеинкиназы находятся на одной полипептидной цепи. цГМФзависимая киназа затем фосфорилирует внутриклеточные белки, что приводит к различным клеточным ответам.

Рецепторы с серин-треонин-киназной активностью фосфорилируют белки только по остаткам серина и/или треонина.

Еще одно семейство мембранных рецепторов, не сопряженных с G-белками, состоит из белков с собственнойтирозин-протеинкиназнойактивностью. Рецепторами с собственной тирозин-протеинкиназной активностью служат белки с гликозилированным внеклеточным доменом, единственным

трансмембранным участком и внутриклеточным доменом с тирозин-протеинкиназной активностью. Связывание с ними агониста, например фактора роста нервов (NGF), стимулирует тирозин-протеинкиназную активность, что фосфорилирует специфичные белки-эффекторы по определенным тирозиновым остаткам. Большинство рецепторов для факторов роста димеризуются, когда с ними связывается NGF. Именно димеризация рецептора ведет к появлению у него тирозинпротеинкиназной активности. Активированные рецепторы часто фосфорилируют сами себя, что называется аутофосфорилированием.

К надсемейству пептидных рецепторов относят рецепторы инсулина. Это также тирозин-протеинкиназы. В подклассе рецепторов, относящихся к семейству инсулиновых рецепторов, нелигандный рецептор существует как дисульфид-связанный димер. Взаимодействие с инсулином приводит к конформационным изменениям обоих мономеров, что повышает связывание инсулина, активирует рецепторную тирозинкиназу и ведет к увеличению аутофосфорилирования рецептора.

Связывание гормона или фактора роста с его рецептором запускает разнообразные клеточные ответы, включая поступление в цитоплазму Са 2+ , увеличение Na + /H + обмена, стимуляцию захвата аминокислот и сахара, стимуляцию фосфолипазы С β и гидролиз фосфатидилинозитолдифосфата.

Рецепторы гормона роста, пролактина и эритропоэтина, также как рецепторы интерферона и многих цитокинов, непосредственно не служат протеинкиназами. Однако после активации эти рецепторы образуют сигнальные комплексы с внутриклеточными тирозин-протеинкиназами, которые и запускают их внутриклеточные эффекты. Именно потому они не являются истинными рецепторами с собственной тирозин-протеинкиназной активностью, а просто связываются с ними.

На основе структуры можно полагать, что трансмембранные тирозин-протеинфосфатазы также представляют собой рецепторы, а их с тирозин-протеинфосфатазная активность модулируется внеклеточными лигандами.

Рис. 2-13. Каталитические рецепторы.

А - рецептор гуанилциклазы, Б - рецептор с серин-треонин киназной активностью, В - рецептор с собственной тирозин-протеинкиназной активностью, Г - рецепторы, ассоциированные с тирозин-протеинкиназной активностью

Рецептор-связанные тирозинпротеинкиназы на примере рецепторов интерферона

Рецепторы интерферона непосредственно не являются протеинкиназами. После активации эти рецепторы образуют сигнальные комплексы с внутриклеточными тирозин-протеинкиназами, которые и запускают их внутриклеточные эффекты. То есть они не являются истинными рецепторами с собственной тирозин-протеинкиназной активностью, а просто связываются с ними таке рецепторы называются рецептор-связанными (рецептор-зависимыми) тирозин-протеинкиназами.

Механизмы, благодаря которому эти рецепторы оказывают действие, запускаются, когда гормон связывается с рецептором, что вызывает его димеризацию. Рецепторный димер связывает одну или несколько членов Janus -семейства тирозин-протеинкиназ (JAK). JAK затем перекрестно

фосфорилируют друг друга, а также рецептор. Члены семейства преобразователей сигнала и активаторов транскрипции (STAT) связывают фосфорилированные домены на комплексе рецептора и JAK. STAT-белки фосфорилируются JAK-киназами и затем отсоединяются от сигнального комплекса. В конечном итоге фосфорилированные STAT-белки образуют димеры, которые двигаются к ядру, чтобы активировать транскрипцию определенных генов.

Специфичность рецептора для каждого гормона отчасти зависит от специфики членов семейства JAK или STAT, объединяющихся для образования сигнального комплекса. В некоторых случаях сигнальный комплекс также активирует MAP-(митоген-активирующий протеин)-киназный каскад с помощью адапторных белков, используемых рецепторными тирозинкиназами. Некоторые из ответов рецепторных тирозинкиназных лигандов также вовлекают JAK и STAT пути.

Рис. 2-14. Пример каталитических рецепторов, ассоциированных с тирозин-протеинкиназной активностью. Рецептор, активируемый α -интерфероном (А) и γ -интерфероном (Б)

Ras-подобные мономерные G-белки и опосредованные ими пути трансдукции

Лиганд, например фактор роста, связывается с рецептором, обладающим собственной тирозинпротеинкиназной активностью, что приводит к увеличению транскрипции в 10-ступенчатом процессе. Ras-подобные мономерные ГТФ-связывающие белки участвуют в пути сигнальной трансдукции на этапе передачи сигнала от рецепторов с собственной тирозин-протеинкиназной активностью (например, рецепторов фактора роста) на внутриклеточные эффекторы. Активация и инактивация мономерных ГТФ-связывающих белков требуют дополнительных регуляторных белков. Мономерные G-белки активируются гуанин-нуклеотид-освобождающими белками (GNRP), а инактивируются ГТФаза-активирующими белками (GAP).

Мономерные ГТФ-связывающие белки семейства Ras служат посредниками связывания митогенных лигандов и их тирозин-протеинкиназных рецепторов, что запускает внутриклеточные процессы, ведущие к пролиферации клеток. Когда Ras-белки неактивны, клетки не реагируют на факторы роста, действующие через тирозинкиназные рецепторы.

Aктивация Ras запускает путь сигнальной трансдукции, приводящий в конечном итоге к транскрипции определенных генов, способствующих клеточному росту. Каскад MAP-киназы (МАРК) вовлекается в ответы при активации Ras. Протеинкиназа С также активирует каскад MAP- киназы. Таким образом, каскад MAP-киназы оказывается важной точкой конвергенции для разнообразных эффектов, вызывающих клеточную пролиферацию. Более того, здесь наблюдается перекрест между протеинкиназой С и тирозинкиназами. Например γ-изоформа фосфолипазы С активируется путем связывания с активированным Ras-белком. Эта активация передается на протеинкиназу С в процессе стимуляции фосфолипидного гидролиза.

На рисунке 2-15 представлен механизм, включающий 10 ступеней.

1. Связывание лиганда приводит к димеризации рецептора.

2.Активированнаятирозин-протеинкиназа (RTK) фосфорилирует себя.

3.GRB 2 (growth factor receptor-bound protein-2), SH 2 -содержащий протеин, узнает фосфотирозиновые остатки на активированном рецепторе.

4.Связывание GRB 2 включает SOS (son of sevenless) обменный протеин гуаниннуклеотида.

5.SOS активирует Ras, формируя на Ras ГТФ вместо ГДФ.

6.Активный комплекс Ras-ГТФ активирует другие протеины физическим включением их в плазматическую мембрану. Активный комплекс Ras-ГТФ взаимодействует с N-терминальной частью серин-треонин киназы Raf-1 (известной как митоген-активирующий протеин, MAP) первой в серии последовательности активированных протеинкиназ, которые передают активационный сигнал в ядро клетки.

7.Raf-1 фосфорилирует и активирует протеинкиназу, названную MEK, которая известна как киназа МАP-киназы (МАРКК). MEK - это мультифункциональная протеинкиназа, фосфорилирующая субстраты остатков тирозина и серина / треонина.

8.MEK фосфорилирует МАP-киназу (МАРК), которая также вызывается внеклеточным сигналом - регуляторной киназой (ERK 1 , ERK 2). Активация МАРК требует двойного фосфорилирования на соседних остатках серина и тирозина.

9.МАРК служит важнейшей эффекторной молекулой в Ras-зависимой сигнальной трансдукции, поскольку она фосфорилирует много клеточных протеинов после митогенной стимуляции.

10.Активированная МАРК переносится в ядро, где она фосфорилирует фактор транскрипции. В целом, активированный Ras активирует МАР

путем связывания с ней. Результатом этого каскада являются фосфорилирование и активация МАР-киназы, которая, в свою очередь, фосфорилирует факторы транскрипции, белковые субстраты и другие протеинкиназы, важные для деления и других ответов клеток. Активация Ras зависит от адаптерных белков, связывающихся с фосфотирозиновыми доменами на активированных факторами роста рецепторах. Эти адаптерные белки присоединяются и активируют GNRF (гуанин-нуклеотидобменный протеин), который активирует Ras.

Рис. 2-15. Регуляция транскрипции Ras-подобными мономерными G-белками, запускаемая с рецептора с собственной тирозин-протеинкиназной активностью

Регуляция транскрипции белком, взаимодействующим с цАМФзависимым элементом ДНК (CREB)

CREB -широко распространенный транскрипционный фактор - в норме связан с участком ДНК, названным CRE (сАМР response element). В отсутствии стимуляции CREB дефосфорилирован и не влияет на транскрипцию. Многочисленные пути сигнальной трансдукции посредством активации киназ (таких, как ПКА, Са 2+ /кальмо- дулин-киназа IV, МАР-киназа) приводят к фосфорилированию CREB. Фосфорилированный CREB связывается CBP (CREB-binding protein - CREB-связывающим протеином), который имеет домен, стимулирующий транскрипцию. Параллельно фосфорилирование активирует РР1

(фосфопротеинфосфатазу 1), которая дефосфорилирует CREB, что приводит к остановке транскрипции.

Показано, что активация CREB-опосредованно- го механизма важна для реализации таких высших когнитивных функций, как обучение и память.

На рисунке 2-15 показано также строение цАМФзависимой ПКА, которая в отсутствии цАМФ состоит из четырех субъединиц: двух регуляторных и двух каталитических. Присутствие регуляторных субъединиц подавляет ферментативную активность комплекса. Связывание цАМФ индуцирует конформационные изменения в регуляторных субъединицах, в результате чего регуляторные субъединицы отделяются от каталитических. Каталитические ПКА попадают в ядро клетки и запускают изложенный выше процесс.

Рис. 2-16. Регуляция генной транскрипции с помощью CREB (сАМР response element binding protein) через увеличение уровня циклического аденозинмонофосфата

При передаче сигналов в клетке первичными посредниками являются химические соединения или физические факторы (квантсвета), способные активировать механизм передачи сигнала в клетке. По отношению к воспринимающей клетке первичные посредники являются экстраклеточными сигналами. Стоит отметить, что в качестве экстраклеточных стимулов могут выступать и молекулы в изобилии присутствующие внутри клетки, но находящиеся в норме в очень низкой концентрации в межклеточном пространстве (например,АТФилиглутамат). В зависимости от функций первичные посредники могут быть разделены на несколько групп:

• цитокины

  нейротрансмиттеры

  факторы роста

  хемокины

Рецепторы – особые белки, обеспечивающие получение клеткой сигнала от первичных посредников. Для этих белков первичные посредники являются лигандами.

Для обеспечения рецепторной функции молекулы белков должны отвечать ряду требований:

Обладать высокой избирательностью к лиганду;

Кинетикасвязываниялигандадолжна описываться кривой с насыщением, соответствующим состоянию полной занятости всех молекул рецепторов, число которых на мембране ограничено;

Рецепторы должны обладать тканевой специфичностью, отражающей наличие или отсутствие данных функций в клетках органа-мишени;

Связывание лиганда и его клеточный (физиологический) эффект должны быть обратимы, параметры сродства должны соответствовать физиологическим концентрациям лиганда.

Клеточные рецепторы делятся на следующие классы:

мембранные

• рецепторные тирозинкиназы

  рецепторы, сопряжённые с G-белками

  ионные каналы

цитоплазматические

Мембранные рецепторы распознают крупные (например, инсулин) или гидрофильные (например, адреналин) сигнальные молекулы, которые не могут самостоятельно проникать в клетку. Небольшие гидрофобные сигнальные молекулы (например, трийодтиронин,стероидные гормоны, CO, NO) способны проникать в клетку за счётдиффузии. Рецепторы таких гормонов обычно являются растворимыми цитоплазматическими или ядерными белками. После связывания лиганда с рецептором информация об этом событии передаётся дальше по цепи и приводит к формированию первичного и вторичного клеточного ответа.

Механизмы активации рецепторов . Если внешняя сигнальная молекулавоздействует нарецепторыклеточной мембраны и активирует их, то последние передают полученную информацию на систему белковых компонентов мембраны, называемую каскадом передачи сигнала. Мембранные белки каскада передачи сигнала подразделяют на:

белки-преобразователи, связанные с рецепторами

ферменты-усилители, связанные с белками-преобразователями (активируютвторичные внутриклеточные посредники, переносящие информацию внутрь клетки).

Так действуют рецепторы, сопряженные с G-белками. Другие рецепторы (ионные каналы, рецепторы спротеинкиназнойактивностью) сами служат умножителями.

4.3.2. Вторичные посредники

Это низкомолекулярные вещества, которые образуются или высвобождаются в результате ферментативной активности одного из компонентов цепи передачи сигнала и способствуют его дальнейшей передаче и амплификации. Вторичные посредники характеризуются следующими свойствами: имеют небольшую молекулярную массу и с высокой скоростью диффундируютвцитоплазме; быстро расщепляются и быстро удаляются из цитоплазмы. Ко вторичным посредникам относятся:

Ионы кальция(Ca2+);

циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) и циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ)

инозитолтрифосфат

липофильные молекулы (например, диацилглицерол);

оксид азота(NO) (эта молекула выступает и в роли первичного посредника, проникающего в клетку извне).

Иногда в клетке образуются и третичные посредники. Так, обычно ионы Ca2+ выступают в роли вторичного посредника, но при передаче сигнала с помощью инозитолтрифосфата (вторичный посредник) выделяющиеся при его участии из ЭПРионы Ca2+ служат третичным посредником.

Механизм передачи сигнала предполагает примерно следующую схему:

Взаимодействие внешнего агента (стимула) с клеточным рецептором,

Активация эффекторной молекулы, находящейся в мембране и отвечающей за генерацию вторичных посредников,

Образование вторичных посредников,

Активация посредниками белков-мишеней, вызывающих генерацию следующих посредников,

Исчезновение посредника.

Передача сигнала в клетке (клеточная сигнализация) - это часть сложной системы коммуникации, которая управляет основными клеточными процессами и координирует действия клетки. Возможность клеток корректно отвечать на изменения окружающей их среды (microenvironment) является основой развития, репарации тканей,иммунитетаи системы поддержаниягомеостазав целом. Ошибки в системах обработки клеточной информации могут привести краку,аутоиммунным заболеваниямидиабету. Понимание механизмов передачи сигнала внутри клетки может привести к разработке методов лечения заболеваний и даже созданию искусственных тканей.

Традиционно биологические исследования сфокусированы на изучении отдельных частей системы передачи сигнала. Знания о компонентах сигнальных систем помогают понять общую структуру сигнальных систем клетки и то, как изменения в них могут повлиять на передачу и утечку информации. Системы передачи сигнала в клетке являются сложно организованными комплексами и обладают такими качествами, как ультрачувствительность и бистабильность (возможность находиться в одном из двух существующих состояний). Анализ систем передачи сигнала в клетке затрагивает комбинацию экспериментальных и теоретических исследований, которые включают в себя развитие и анализ моделей и симуляторов.

Резюме. В данной главе рассмотрены основные закономерности и проблемы молекулярной биологии на примере явления программируемой клеточной смерти (апоптоза), межклеточного и внутриклеточного взаимодействия, использования молекулярно-генетических маркеров (на примере полимеразно-цепной реакции) в фундаментальных и прикладных целях.

Контрольные задания

Происхождение и эволюция апоптоза у разных групп организмов.

Характеристика и основные пути индукции основных фаз апоптоза.

Основные механизмы регуляции апоптоза.

Патологии, обусловленные нарушениями процесса апоптоза.

Основные типы молекулярно-генетических маркеров.

История открытия, методика проведения полимеразно-цепной реакции.

Особенности проведения и применения основных разновидностей ПЦР.

Значение сигнальной трансдукции при межклеточных и внутриклеточных взаимодействиях.

Механизмы активации рецепторных белков.

Механизмы передачи сигналов при межклеточном взаимодействии.

Мессенджеры – низкомолекулярные вещества, переносящие сигналы гормонов внутри клетки. Они обладают высокой скоростью перемещения, расщепления или удаления (Са 2+ , цАМФ, цГМФ, ДАГ, ИТФ).

Нарушения обмена мессенджеров приводят к тяжелым последствиям. Например, форболовые эфиры, которые являются аналогами ДАГ, но в отличие от которого в организме не расщепляются, способствуют развитию злокачественных опухолей.

цАМФ открыта Сазерлендом в 50 годах прошлого века. За это открытие он получил Нобелевскую премию. цАМФ участвует в мобилизации энергетических запасов (распад углеводов в печени или триглицеридов в жировых клетках), в задержке воды почками, в нормализации кальциевого обмена, в увеличении силы и частоты сердечных сокращений, в образовании стероидных гормонов, в расслаблении гладких мышц и так далее.

цГМФ активирует ПК G, ФДЭ, Са 2+ -АТФазы, закрывает Са 2+ -каналы и снижает уровень Са 2+ в цитоплазме.

Ферменты

Ферменты каскадных систем катализируют:

• образование вторичных посредников гормонального сигнала;
• активацию и ингибирование других ферментов;
• превращение субстратов в продукты;

Аденилатциклаза (АЦ)

Гликопротеин с массой от 120 до 150 кДа, имеет 8 изоформ, ключевой фермент аденилатциклазной системы, с Mg 2+ катализирует образование вторичного посредника цАМФ из АТФ.

АЦ содержит 2 –SH группы, одна для взаимодействия с G-белком, другая для катализа. АЦ содержит несколько аллостерических центров: для Mg 2+ , Mn 2+ , Ca 2+ , аденозина и форсколина.

Есть во всех клетках, располагается на внутренней стороне клеточной мембраны. Активность АЦ контролируется: 1) внеклеточными регуляторами - гормонами, эйкозаноидами, биогенными аминами через G-белки; 2) внутриклеточным регулятором Са 2+ (4 Са 2+ -зависимые изоформы АЦ активируются Са 2+).

Протеинкиназа А (ПК А)

ПК А есть во всех клетках, катализируют реакцию фосфорилирования ОН- групп серина и треонина регуляторных белков и ферментов, участвует в аденилатциклазной системе, стимулируется цАМФ. ПК А состоит из 4 субъединиц: 2 регуляторных R (масса 38000 Да) и 2 каталитических С (масса 49000 Да). Регуляторные субъединицы имеют по 2 участка связывания цАМФ. Тетрамер не обладает каталитической активностью. Присоединение 4 цАМФ к 2 субъединицам R приводит к изменению их конформации и диссоциации тетрамера. При этом высвобождаются 2 активные каталитические субъединицы С, которые катализируют реакцию фосфорилирования регуляторных белков и ферментов, что изменяет их активность.

Протеинкиназа С (ПК С)

ПК С участвует в инозитолтрифосфатной системе, стимулируется Са 2+ , ДАГ и фосфатидилсерином. Имеет регуляторный и каталитический домен. ПК С катализирует реакцию фосфорилирования белков-ферментов.

Протеинкиназа G (ПК G) есть только в легких, мозжечке, гладких мышцах и тромбоцитах, участвует в гуанилатциклазной системе. ПК G содержит 2 субъединицы, стимулируется цГМФ, катализирует реакцию фосфорилирования белков-ферментов.

Фосфолипаза С (ФЛ С)

Гидролизует фосфоэфирную связь в фосфатидилинозитолах с образованием ДАГ и ИФ 3 , имеет 10 изоформ. ФЛ С регулируется через G-белки и активируется Са 2+ .

Фосфодиэстеразы (ФДЭ)

ФДЭ превращает цАМФ и цГМФ в АМФ и ГМФ, инактивируя аденилатциклазную и гуанилатциклазную систему. ФДЭ активируется Са 2+ , 4Са 2+ -кальмодулином, цГМФ.

NO-синтаза – это сложный фермент, представляющий собой димер, к каждой из субъединиц которого присоединено несколько кофакторов. NO-синтаза имеет изоформы.

Синтезировать и выделять NO способно большинство клеток организма человека и животных, однако наиболее изучены три клеточные популяции: эндотелий кровеносных сосудов, нейроны и макрофаги. По типу синтезирующей ткани NO-синтаза имеет 3 основные изоформы: нейрональную, макрофагальную и эндотелиальную (обозначаются соответственно как NO-синтаза I, II и III).

Нейрональная и эндотелиальная изоформы NO-синтазы постоянно присутствуют в клетках в небольших количествах, и синтезируют NO в физиологических концентрациях. Их активирует комплекс кальмодулин-4Са 2+ .

NO-синтаза II в макрофагах в норме отсутствует. При воздействии на макрофаги липополисахаридов микробного происхождения или цитокинов они синтезируют огромное количество NO-синтазы II (в 100-1000 раз больше чем NO-синтазы I и III), которая производит NO в токсических концентрациях. Глюкокортикоиды (гидрокортизон, кортизол), известные своей противовоспалительной активностью, ингибируют экспрессию NO-синтазы в клетках.

Действие NO

NO - низкомолекулярный газ, легко проникает через клеточные мембраны и компоненты межклеточного вещества, обладает высокой реакционной способностью, время его полураспада в среднем не более 5 с, расстояние возможной диффузии небольшое, в среднем 30 мкм.

В физиологических концентрациях NO оказывает мощное сосудорасширяющее действие :

· Эндотелий постоянно продуцирует небольшие количества NO.

· При различных воздействиях – механических (например, при усилении тока или пульсации крови), химических (липополисахариды бактерий, цитокины лимфоцитов и кровяных пластинок и т.д.) – синтез NO в эндотелиальных клетках значительно повышается.

· NO из эндотелия диффундирует к соседним гладкомышечным клеткам стенки сосуда, активирует в них гуанилатциклазу, которая синтезирует через 5с цГМФ.

· цГМФ приводит к снижению уровня ионов кальция в цитозоле клеток и ослаблению связи между миозином и актином, что и позволяет клеткам через 10 с расслабляться.

На этом принципе действует препарат нитроглицерин. При расщеплении нитроглицерина образуется NO, приводящий к расширению сосудов сердца и снимающий в результате этого чувство боли.

NO регулирует просвет мозговых сосудов. Активация нейронов какой-либо области мозга приводит к возбуждению нейронов, содержащих NO-синтазу, и/или астроцитов, в которых также может индуцироваться синтез NO, и выделяющийся из клеток газ приводит к локальному расширению сосудов в области возбуждения.

NO участвует в развитии септического шока, когда большое количество микроорганизмов, циркулирующих в крови, резко активируют синтез NO в эндотелии, что приводит к длительному и сильному расширению мелких кровеносных сосудов и как следствие – значительному снижению артериального давления, с трудом поддающемуся терапевтическому воздействию.

В физиологических концентрациях NO улучшает реологические свойства крови :

NO, образующийся в эндотелии, препятствует прилипанию лейкоцитов и кровяных пластинок к эндотелию и также снижает агрегацию последних.

NO может выступать в роли антиростового фактора, препятствующего пролиферации гладкомышечных клеток стенки сосудов, важного звена в патогенезе атеросклероза.

В больших концентрациях NO оказывает на клетки (бактериальные, раковые и т.д) цитостатическое и цитолитическое действие следующим образом:

· при взаимодействии NO с радикальным супероксид анионом образуется пероксинитрит (ONOO-), который является сильным токсичным окислителем;

· NO прочно связывается с геминовой группой железосодержащих ферментов и ингибирует их (ингибирование митохондриальных ферментов окислительного фосфорилирования блокирует синтез АТФ, ингибирование ферментов репликации ДНК способствуют накоплению в ДНК повреждений).

· NO и пероксинитрит могут непосредственно повреждать ДНК, это приводит к активации защитных механизмов, в частности стимуляции фермента поли(АДФ-рибоза) синтетазы, что еще больше снижает уровень АТФ и может приводить к клеточной гибели (через апоптоз).

Похожая информация.

Рис. 3. Схема стимулирования распада гликогена повышением уровня цАМФ

Цитоскелет сигнализирует

Регулируемая цАМФ каскадная схема взаимодействий ферментов кажется непростой, а в действительности устроена еще более сложно. В частности, связавшиеся с первичными мессенджерами рецепторы оказывают влияние на активность аденилатциклазы не непосредственно, а через так называемые G-белки (рис. 4), работающие под контролем гуанинтрифосфорной кислоты (ГТФ).

А что происходит, когда почему-либо нарушается нормальная связь событий? Примером может быть заболевание холерой. Токсин холерного вибриона оказывает воздействие на уровень ГТФ и влияет на активность G-белков. В результате уровень цАМФ в клетках кишечника больных холерой оказывается постоянно высоким, что вызывает переход больших количеств ионов натрия и воды из клеток в просвет кишечника. Следствие этого – изнуряющие поносы и потеря воды организмом.

В норме под воздействием фермента фосфодиэстеразы цАМФ в клетке быстро инактивируется, превращаясь в нециклический аденозинмонофосфат АМФ. Течение другого заболевания – коклюша, вызываемого бактериями Bordetella pertussis, сопровождается образованием токсина, который тормозит превращение цАМФ в АМФ. Отсюда возникают и неприятные симптомы болезни – покраснение горла и доходящий до рвоты кашель.

На активность фосфодиэстеразы, превращающей цАМФ в АМФ, влияют, например, кофеин и теофиллин, что обуславливает стимулирующее действие кофе и чая.

Многообразие эффектов цАМФ и способов регуляции его концентрации в клетках делает его универсальным вторичным мессенджером, играющим ключевую роль в активации различных протеинкиназ.

В разных клетках цАМФ может приводить к совершенно различным эффектам. Это соединение не только принимает участие в распаде гликогена и жиров, но также увеличивает частоту сердечных сокращений, влияет на расслабление мускулатуры, контролирует интенсивность секреции и скорость поглощения жидкостей. Оно является вторичным мессенджером для целого спектра различных гормонов: адреналина, вазопрессина, глюкагона, серотонина, простогландина, тироид-стимулирующего гормона; цАМФ работает в клетках скелетной мускулатуры, сердечной мышцы, в гладких мышцах, почках, печени, в тромбоцитах.

Резонно возникает вопрос: почему же различные клетки реагируют на цАМФ по разному? Можно сформулировать его и иначе: почему при повышении концентрации цАМФ в разных клетках активируются различные протеинкиназы, которые фосфорилируют разные белки? Эту ситуацию можно проиллюстрировать с помощью такой аналогии. Представьте себе, что к двери офиса постоянно подходят различные визитеры – лиганды и первичные мессенджеры. При этом они звонят в один-единственный звонок: раздается сигнал – вторичный мессенджер. Как при этом служащим заведения определить, кто именно пожаловал с визитом и как надо реагировать на данного посетителя?

Загадка ионов кальция

Рассмотрим сначала, что происходит со вторым чрезвычайно распространенным вторичным мессенджером – кальцием, вернее его ионами. Впервые их ключевая роль в ряде биологических реакций была показана еще в 1883 г. когда Сидней Рингер заметил, что изолированные мышцы лягушки не сокращаются в дистиллированной воде. Чтобы в ответ на электрическую стимуляцию мышца сократилась, ей необходимо присутствие в окружающей ее среде ионов кальция.

Теперь последовательность основных событий, происходящих при сокращении скелетной мускулатуры, хорошо известна (рис. 5). В ответ на электрический импульс, который доходит до мышцы по аксону нервной клетки, внутри мышечной клетки – миофибриллы – открываются резервуары ионов кальция – мембранные цистерны, в которых концентрация ионов кальция может быть выше, чем в цитоплазме, в тысячу и более раз (рис. 6). Высвободившийся кальций соединяется с белком тропонином С, который связан с выстилающими внутреннюю поверхность клетки актиновыми филаментами. Тропонин (рис. 7) играет роль блокатора, препятствующего скольжению миозиновых нитей по актиновым филаментам. В результате присоединения кальция к тропонину блок отсоединяется от нити, миозин скользит по актину, и мышца сокращается (рис. 8). Как только акт сокращения заканчивается, специальные белки – кальциевые АТФазы – закачивают ионы кальция обратно во внутриклеточные резервуары.

На концентрацию внутриклеточного кальция оказывают влияние не только нервные импульсы, но и другие сигналы. Например, это может быть уже знакомый нам цАМФ. В ответ на появление адреналина в крови и соответствующее повышение концентрации цАМФ в клетках сердечной мышцы в них высвобождаются ионы кальция, что приводит к учащению сердцебиения.

Вещества, оказывающие влияние на кальций, могут содержаться также непосредственно в клеточной мембране. Как известно, мембрана состоит из фосфолипидов, среди которых один – фосфоинозитол-4, 5-дифосфат – играет особую роль. Помимо инозита молекула фосфоинозитол-4, 5-дифосфата содержит две длинные углеводородные цепи, состоящие из 20 и 17 атомов углерода (рис. 9). Под воздействием определенных внеклеточных сигналов и под контролем уже знакомых читателям G-белков они отсоединяются, в результате чего образуются две молекулы – диацилглицерин и инозитолтрифосфат. Последний участвует в высвобождении внутриклеточного кальция (рис. 10). Такого рода сигнализация используется, например, в оплодотворенной икре шпорцевой лягушки.

Проникновение первого же из множества спермиев в готовую для оплодотворения икринку вызывает образование в ее мембране инозитолтрифосфата. В результате ионы кальция высвобождаются из внутренних резервуаров и оболочка оплодотворенной яйцеклетки мгновенно разбухает, отсекая путь внутрь яйцеклетки менее удачливым или менее расторопным сперматозоидам.

Как же такое простое вещество, как ион кальция, может регулировать активность белков? Выяснилось, что он связывается внутри клетки со специальным белком кальмодулином (рис. 11). Этот достаточно крупный белок, состоящий из 148 аминокислотных остатков, как и цАМФ, обнаружен практически во всех изученных клетках.