Уникальным свойством антигена, проникшего в организм, яв­ляется его способность специфически связываться с лимфоцитами и активировать их.

Согласно клонально-селекционной теории, выдвинутой в 1959 г. Бернетом, при нормальном развитии в организме возникает набор из тысяч очень небольших по объему субпопуляций лимфоцитов, имеющих на наружной мембране рецепторы лишь к одной какой-то детерминанте. Иммунный ответ оказывается специфическим в силу того, что проникший в организм антиген избирательно свя­зывается только с теми клетками, на поверхности которых имеют­ся соответствующие рецепторы. С остальными клетками этот ан­тиген не взаимодействует.

Связывание антигена индуцирует активацию лимфоцита, то есть запускает ряд процессов, приводящих к клеточному деле­нию и дифференцировке. В процессе дифференцировки лим­фоцитов происходит развитие таких эффекторных функций,

как антителообразование у В-клеток и появление цитотокси-ческой активности у части Т-клеток.

Под активацией лимфоцитов понимается достаточно слож­ный процесс перехода клетки из фазы G0 в фазу G1, вызванный взаимодействием со стимулирующим агентом (например, антиге­ном или митогеном). Термин «покоящийся лимфоцит» относится к лимфоцитам, которые находятся в фазе G0 (в этой фазе клеточ­ного цикла клетки не делятся), характеризующейся низким уров­нем метаболической активности, т. е. низкой скоростью синтеза белков и РНК при отсутствии синтеза ДНК. Реагирующие с анти­геном клетки согласно клонально-селекционной теории Бернета обычно находятся в покоящемся состоянии до получения стиму­лирующего сигнала.

При взаимодействии с антигеном в ранее «покоившихся лим­фоцитах» наряду с метаболическими изменениями, характерными для делящихся клеток, происходят процессы созревания, различ­ные в разных субпопуляциях лимфоцитов. В итоге каждая субпо­пуляция приобретает набор присущих только ей поверхностных антигенов и специфических функций.

Последовательность процессов активации лимфоцитов в об­щем виде может быть представлена следующим образом. Рецепто­ры на поверхности лимфоцита связывают стимулирующий лиганд (например, антиген) и сшиваются друг с другом, образуя неболь­шие локальные кластеры сшитых рецепторов, которые становятся наиболее эффективными в передаче активирующего сигнала.

Локальные кластеры повышают проницаемость мембраны лим­фоцита для одновалентных катионов, поступающих внутрь клет­ки, что приводит к деполяризации мембраны и локальному увели­чению концентрации Na + -, K + -АТФазы. Вследствие сшивки ре­цепторов лимфоцита активируется мембранная метилтрансфе-раза, которая катализирует образование достаточного количества монометилфосфатидилэтаноламина, повышающего текучесть мем­браны и вызывающего ее локальную перестройку. В результате этого открываются каналы, через которые ионы Са 2+ проникают (диффундируют) в лимфоцит. Вследствие такого локального уве­личения концентрации Са 2+ с внутренней стороны мембраны ак­тивируется фосфолипаза А2, катализирующая образование лизо-лецитина и арахидоновой кислоты из фосфатидилхолина. Эти ре­акции происходят в течение первых 30 мин после контакта лим­фоцита с антигеном.

Одновременно ионы Са 2+ активируют и другой цитоплазматичес-кий фермент, расщепляющий фосфатидилинозитол (по крайней мере в Т-клетках). Высвобождающаяся арахидоновая кислота при участии липоксигеназы и циклоксигеназы расщепляется с образова­нием лейкотриенов и простагландинов (одни продукты каскада ара­хидоновой кислоты регулируют синтез РНК и ДНК, другие - влия­ют на поглощение ионов Са 2+ или активность аденилатциклазы).

Лизолецитин с помощью ионов Са 2+ активирует гуанилат-циклазу, а активность аденилатциклазы уменьшается вследствие ее соседства с Ш + -К + -АТФазой, конкурирующей с ней за АТФ. Все это приводит к временному увеличению концентрации цГМФ, активирующего протеинкиназы, трансферазы жирных кислот и ферменты, увеличивающие синтез мембранных фосфолипидов. Из других протеинкиназ важное значение имеет активация проте-инкиназ, способствующих биосинтезу матричной РНК, полиами­нов и переносу метальных групп.

Поскольку транспорт глюкозы в клетку является Са-зависи-мым процессом, то поток ионов Са 2+ играет важную роль в уве­личении скорости ее транспорта, т. е. поставки исходного ма­териала для обеспечения множества энергозависимых синте­тических процессов. Повышенный транспорт аминокислот и нуклеотидов в клетку вызывает повышенное образование липо-сом, увеличение синтеза рибосомной и матричной РНК и синте­за белка в целом.

Поток ионов Са 2+ активирует сериновую эстеразу, вызываю­щую повышение клеточной подвижности благодаря изменениям в системе циклических нуклеотидов. Кроме того, сериновая эстера-за опосредованно активирует ядерную аденилатциклазу. Увеличе­ние в ядре концентрации цАМФ вызывает активацию киназ, спе­цифически фосфорилирующих кислые негистоновые белки, регу­лирующие транскрипцию и синтез ДНК. Это приводит к синтезу РНК и ДНК, начинающегося на 3-й сутки и достигающего макси­мума на 4...6-е сутки.

Среди факторов, влияющих на активацию лимфоцитов, следу­ет отметить следующие:

антигены, к которым имеются специфические рецепторы на лимфоцитах; популяцию таких лимфоцитов называют антиген-связывающими клетками;

антитела к иммуноглобулинам; сшивка поверхностных имму­ноглобулинов В-клеток с бивалентными антителами к этим имму­ноглобулинам;

интерлейкины IL-1, IL-2;

инсулин; он опосредованно, через активацию аденилатцикла­зы, активирует лимфоциты.

Ингибирующее влияние на лимфоциты оказывают следую­щие факторы:

липиды; наибольшей ингибирующей способностью из липо-протеидов обладают липопротеиды очень низкой плотности (ЛОНП), обусловливающие разобщение между потоком ионов Са 2+ в клетку и концентрацией образующихся при этом цикличес­ких нуклеотидов;

фрагменты компонентов системы комплемента СЗе, СЗс и C3d; они ингибируют пролиферацию Т-клеток и синтез антител в ответ на стимуляцию с помощью антигена.

Несмотря на то что механизмы активации лимфоцитов раз­личных популяций характеризуются определенной общностью, следует отметить и те особенности, которые наблюдаются при активации Т- и В-лимфоцитов, имеющих различные поверхност­ные маркеры, с помощью которых эти клетки взаимодействуют с внешними факторами.

Активация В-лимфоцитов. В-лимфоциты реагируют на три раз­личных типа антигенов:

2. Тимуснезависимый антиген типа 2 (например, не­которые линейные антигены, имеющие часто повторяющуюся, определенным образом организованную детерминанту, - полиме­ры D-аминокислот, поливонил-пирролидон, полисахарид пнев­мококков).

Эти антигены, длительно персистируя на поверхности спе­циализированных макрофагов краевого лимфатического узла и селезенки, специфически связываются с иммуноглобулиновыми рецепторами В-клеток. Таким образом, оба тимуснезависимых ан­тигена способны непосредственно, т. е. без участия Т-клеток, сти­мулировать В-лимфоциты и вызывать преимущественно синтез IgM. Индуцируемый ими иммунный ответ практически не сопро­вождается формированием клеток памяти.

3. Тимусзависимый антиген. Многие антигены
относятся к группе тимусзависимых. В отсутствие Т-лимфоцитов
эти антигены лишены иммуногенности - связавшись с В-клеточ-
ным рецептором, они, подобно гаптенам, не способны активиро­
вать В-клетку. Одна антигенная детерминанта тимусзависимого
антигена связывается с В-клеткой, а остальные - с Т-хелпером,
активируя его. Т-хелперы должны распознавать детерминанты но­
сителя на поверхности реагирующей В-клетки.

Антиген, связавшийся с поверхностными /gA-клетками, попа­дает в эндосомы вместе с молекулами МНС класса II, а затем возвращается на поверхность А-клетки в процессированной фор­ме. Он ассоциирован с молекулами МНС класса II и доступен для распознавания специфическими Т-хелперами. Носитель процессируется в В-клетках, запрограммированных на синтез антител к гаптену. После стимуляции Т-хелперами, распознаю­щими процессированный носитель, В-клеткам удается выпол­нить свою программу, т. е. начать производить антитела, реаги­рующие с гаптеном.

Механизм активации клеток. Связывание поверхностных рецеп­торов (IgM) В-клеток с антигеном или антителами к этим рецеп­торам вызывает совокупность последовательных реакций, анало­гичных реакциям при активации Т-клеток (поступление в В-лим-фоцит ионов Са 2+ и активация протеинкиназ) - это один меха­низм. Другой, имеющий важное значение для Т-зависимых ан-

Тигенов, - это увеличение экспрессии поверхностных молекул МНС класса II уже на самых ранних этапах активации В-клеток. С моле­кулами МНС класса II и процессированным антигеном связывается Т-хелпер, который продуцирует факторы (например, BSF-1 - от англ. B-cell stimulatory factor), обусловливающие переход В-кле­ток в фазу G-1 клеточного цикла. Как и активированная Т-клетка, стимулированный В-лимфоцит приобретает многочисленные по­верхностные рецепторы для ростовых факторов, выделяемых Т-хел-перами, в этом состоянии он готов к пролиферации - основному процессу в следующей фазе иммунного ответа.

Первыми начинают делиться Т-хелперы, на поверхности ко­торых экспрессируются высокоаффинные рецепторы к IL-2. Эти клетки пролиферируют в ответ либо на собственный IL-2, либо на IL-2, продуцируемый субпопуляцией Т-хелперов. Проли­ферацию В-клеточного клона обеспечивают Т-клеточные раство­римые факторы, в частности BSF-1 (фактор роста В-клеток, име­нуемый чаще интерлейкином-4), выделяемые активированными Т-клетками. Под влиянием других факторов (например, BCDF - от англ. B-cell differentiation factor) происходит созревание клона В-лимфобластов и ускорение их преобразования в плазматичес­кие клетки с высоким уровнем секреции IgM. Другой дифферен-цировочный фактор BCDF (также синтезируется активирован­ными Т-хелперами) переключает синтез с IgM на IgG и индуциру­ет те изменения, которые необходимы для обеспечения высокой скорости синтеза антител.

Активация Т-лимфоцитов. Для активации необходимо два сиг­нала. Роль первого сигнала может выполнять антиген (или мито-ген), связанный с молекулой МНС класса II на поверхности анти-генпрезентирующей клетки. Тройное взаимодействие между ан­тигеном, гликопротеином МНС и рецептором Т-лимфоцита гене­рирует сигнал, передаваемый через комплекс рецептора с моле­кулой CD-3 (это мембраносвязанный белковый комплекс, пред­ставляющий собой антигенспецифический Т-клеточный ре­цептор периферических Т-лимфоцитов), и одновременно обес­печивает воздействие на клетку высокой локальной концентра­ции IL-1 (второй сигнал), продуцируемого антигенпрезентирую-щей клеткой.

Активированные Т-клетки секретируют:

IL-2, стимулирующий деление клеток, имеющих рецептор к IL-2;

лимфокин BSF-1, активирующий В-клетки;

лимфокин BSF -2, стимулирующий клональную экспансию ак­тивированных В-лимфоцитов;

лимфокин BCDF -фактор дифференцировки В-клеток, спо­собствующий созреванию клеток с высокой скоростью секре­ции IgM;

лимфокин BCDF-фактор, вызывающий переключение с син­теза IgM на IgG и высокую скорость секреции последнего.

Под активацией клеток понимают их переход из состояния покоя в функционально активное состояние - макрофаги продуцируют активные формы кислорода, тучные клетки выбрасывают гранулы, мышечные клетки сокращаются и т.д. В случае лимфоцита активация также означает выход из состояния покоя (G0), но в несколько ином смысле: покоящийся лимфоцит находится вне клеточного цикла, а его активация означает вступление в цикл. Это последствие активации лимфоцитов глубоко функционально, поскольку любому проявлению функции лимфоцитов должно предшествовать их размножение (поскольку исходная численности клеток в каждом клоне мала). Это не относится к естественным киллерам - лимфоцитам, популяция которых не имеет клональной структуры. Активация NK-клеток не связана с пролиферацией и означает переход в состояние готовности выполнять цитотоксическую функцию.
Молекулярные основы активации Т-клеток
Активация клеток, в том числе лимфоцитов, всегда сопряжена с экспрессией многих генов. В случае лимфоцитов активация должна приводить прежде всего к экспрессии генов, обеспечивающих пролиферативную экспансию клона. Суть подготовки Т-клеток к пролиферации состоит прежде всего в экспрессии генов аутокринного ростового фактора - IL-2 и его рецептора, а точнее a-цепи этого рецептора, обеспечивающей достижение необходимого уровня сродства к цитокину, что служит условием выполнения рецептором его функций. Оба эти гена являются индуцибельными, т.е. в покоящемся состоянии они выключены, но экспрессируются в ответ на индуцирующее воздействие. Сигнал к включению гена поступает из его регуляторного (промоторного) участка, в котором расположены сайты специфического взаимодействия с определенными белками - транскрипционными факторами. Некоторые их таких белков исходно представлены в клетке в активной форме, но большинство отсутствует и может быть синтезировано de novo или активировано путем фосфорилирования или удаления ингибирующей субъединицы. Таким образом, молекулярная основа активации - образование необходимых транскрипционных факторов, обеспечивающих включение индуцибельных генов.
На Т-лимфоциты активирующее воздействие оказывают индукторы активации. В физиологических условиях таким индуктором служит антигенный стимул. Само по себе распознавание антигена при контакте Т-хел- пера с АПК не может повлиять на активность гена в силу пространственной разобщенности мембранного рецептора и генов, локализующихся в ядре. TCR проникает внутрь клетки после связывания с антигеном, но не для того, чтобы мигрировать в ядро и повлиять на активность гена, а для того, чтобы быть расщепленным. Однако при связывании антигенного комплекса с TCR в сочетании с костимулирующим воздействием возникает сигнал, достигающий ядра и регулирующий экспрессию генов. Передача сигнала осуществляется по каскадному принципу. На разных этапах передачи сигнала ее осуществляют молекулы ферментов (главным образом, протеинкиназы, активирующие белки на каждой очередной стадии передачи сигнала), а также адапторные и ГТФ-связывающие белки. Сигнал исходно является двойственным, поскольку его передача осуществляется одновременно от TCR и CD28. Затем эти пути пересекаются и вновь разделяются на несколько ветвей. Конечный результат передачи сигнала по каждому сигнальному пути - формирование транскрипционного фактора. На рис. 3.90 представлена типовая схема внутриклеточной передачи сигнала, завершающейся формированием транскрипционных факторов и активацией генов. Для активации Т-клеток требуется формирование трех транскрипционных факторов - NF-AT, NF-kB и AP-1. Далее рассмотрим осуществление внутриклеточной передачи сигнала на примере активации Т-хелперов при распознавании презентируемого дендритными клетками антигена.
Связывание комплекса MHC-II-пептид вызывает конформационные изменения молекулы TCR и связанной с ней молекулы корец ептора CD4. Пока окончательно не известно, происходит ли при этом только изменение конформации рецепторов или они олигомеризуются. Такие изменения активируют тирозинкиназы, ассоциированные с рецептором и корецеп- тором - Lck (p56lck), связанную с CD4, и Fyn (p59fyn), связанную с CD3. Указанные тирозинкиназы называют рецепторными, или проксимальными, в связи с тем, что они непосредственно примыкают к рецептору, входя в рецепторный комплекс. Обе упомянутые киназы относят к семейству Src-киназ. Киназы этого семейства содержат домены SH1, SH2 и SH3 (SH - от Src-homology) (рис. 3.91). Первый домен обладает ферментативной активностью, остальные взаимодействуют с другими киназами и адапторными белками. Функция тирозинкиназ состоит в фосфорилировании по остатку тирозина белков-мишеней, что необходимо для их активации и проявления функций, в том числе ферментативных. Мишени рецепторных киназ многочисленны. К ним относят сами молекулы Fyn и Lck (что обусловливает их аутофосфорилирование), а также полипептидные цепи TCR и другие киназы. Особенно многообразны мишени киназы Lck.
Однако первоначальным условием активации рецепторных киназ является, наоборот, их дефосфорилирование, обеспечивающее пере-

ход из гиперфосфорилированного в нормальное состояние. Дело в том, что в покоящейся клетке SH2-домен киназы Lck находится в свернутой форме вследствие фосфорилирования С-концевого остатка тирозина Y505 конститутивно активированной киназой Csk. Фосфорилированный Y505 взаимодействует с помощью фосфатной группы с остатком тирозина в Sffi-домене, к которому и подтягивается С-конец молекулы. В таком виде фермент не активен, поскольку при этом не может быть фосфори- лирован функционально важный остаток Y394 в домене SH1. Для снятия такой функциональной блокады необходимо дефосфорилирование с последующим развертыванием молекулы, что осуществляется с участием тирозинфосфатаз. Основную роль в переводе рецепторных киназ в «рабочее» состояние выполняет молекула CD45, цитоплазматический домен которой обладает активностью тирозинфосфатазы. Ранее уже упоминалось, что эта крупная молекула, препятствующая формированию тесного контакта между дендритной клеткой и Т-хелпером, вначале удаляется из зоны иммунного синапса, а затем часть молекул возвращается в эту зону для выполнения своей функции - дефосфорилирования молекул рецепторных тирозинкиназ. После того как остаток Y394 становится доступным для фосфорилирования, Lck может проявлять активность тирозинкиназы.
В генерации сигналов, передаваемых от полипептидных цепей комплекса TCR-CD3, наиболее важно наличие в цитоплазматическом участке у-, 5-, е- и Z-цепей активационной последовательности ITAM, о которой уже неоднократно упоминалось. Структура этого мотива такова: YXXI/L/ VX(6-8)YXXI/L/V (где Y - тирозин, Х - любой остаток, I/L/V - изолейцин, лейцин или валин) (рис. 3.92). Фосфорилирование остатков тирозина

Рис. 3.92. Сопоставление характеристик активационных и ингибирующих мотивов (ITAM и ITIM)

в ITAM делает этот участок доступным для распознавания аналогичными участками сигнальных молекул, расположенных более дистально. Среди полипептидных цепей TCR наиболее важна для передачи сигнала Z-цепь. В отличие от у-, 5- и е-цепей TCR, имеющих по одному участку ITAM, в цитоплазматической части Z-цепи расположены 3 последовательности ITAM, предназначенные для взаимодействия с остатками тирозина тирозинкиназы ZAP-70 (от Z-associated protein - ^-ассоциированный белок; масса 70 кДа) - ключевого фактора в передаче сигнала от TCR при его связывании с лигандом. Фосфорилирование Z-цепи является наиболее ответственным и в то же время наиболее уязвимым этапом активации Т-клеток. Полагают, что именно для обеспечения фосфорилирования всех мотивов ITAM этой молекулы необходимо длительное поддержание контакта Т-лимфоцитов и дендритных клеток. В Z-цепи покоящейся Т-клетки фосфорилирован 1 остаток тирозина; отсутствие фосфорилирования приводит к развитию апоптоза (рис. 3.93). После взаимодействия Z-цепи и ZAP-киназы запус-

Рис. 3.94. Схема сигнальных путей при активации Т-клеток. Распознавание комплекса молекулы МНС с антигенным эпитопом в сочетании с костимуляцией индуцирует запуск сигналов, передаваемых в ядро с помощью 5 каскадов, обеспечивающих формирование 3 транскрипционных факторов, необходимых для активации клетки. Жирным контуром обведены факторы, для которых показана высокая степень зависимости от костимуляции

кается полномасштабный процесс в виде нескольких параллельных путей передачи активационного сигнала (рис. 3.94).
Молекулу ZAP-70 относят к тирозинкиназам семейства Syk. Она содержит тандем из двух SH2-доменов. Условие ее взаимодействия с фцепью - предварительное фосфорилирование остатков тирозина в ITAM фцепи. После фосфорилирования 2-й остаток тирозина в мотивах ITAM фцепи взаимодействует с тирозином S^-доменов киназы ZAP-70. В результате фосфатная группа тирозина фцепи становится общей с тирозином Sffi-домена молекулы ZAP-70. За этим следует фосфорилирование остатков тирозина в ферментативном домене молекулы ZAP-70, осуществляемое тирозинкиназами Lck и, возможно, Fyn, что приводит к включению ферментативной (киназной) активности молекулы.
Дальнейшая передача сигнала обусловлена взаимодействием ZAP-70 с ее главным субстратом - адапторным белком LAT (от Linker for activation of T-cells - линкер активации Т-клеток). Этот белок связан с мембраной и входит в состав рафтов. После катализируемого ZAP-70 фосфорилирования LAT приобретает способность связывать сигнальные молекулы, участвующие в дальнейшей передаче сигнала: адапторные белки SLP-76, Grb2, фактор Vav, а также ферменты - PLCy1 и PI3K. Активация некоторых из упомянутых белков зависит от LAT не напрямую, а косвенно. Так, через SH3-домены

адапторных белков семейства Grb2 к сигнальному пути подсоединяются факторы SLP-76 и Sos. SLP-76, в свою очередь, опосредует подключение к сигнальному пути PLСy1 и ГТФазы Ras. Активация PLCy1 происходит с участием тирозинкиназы Itk, относящейся к семейству Btk - третьему (после Src и Syk) семейству тирозинкиназ, участвующих во внутриклеточной передаче сигнала при активации лимфоцитов. Все сигнальные факторы, вовлекаемые в процесс активации с прямым и косвенным участием LAT, рекрутируются в состав клеточной мембраны и взаимодействуют с ее фосфоинозитидными компонентами. Комплекс, образуемый при взаимодействии SLP-76, Vav и Nck, реагирует с белками цитоскелета PAK и WASP, служащими медиаторами перестроек в цитоскелете активируемых клеток.
Активированная PLCy1 катализирует расщепление фосфатидилино- зитол 4,5-бифосфата с образованием диацилглицерола (DAG), который остается связанным с мембраной, и инозитол-1,4,5-трифосфата (рис. 3.95). Инозитол трифосфат поступает в цитоплазму и взаимодействует с рецепторами на поверхности эндоплазматического ретикулума, что обусловливает выход ионов Са2+ из внутриклеточных хранилищ. Опустошение последних вызывает открытие Са2+-зависимых каналов в клеточной мембране, через которые в клетку поступают ионы Са2+ из внеклеточного пространства. В результате возрастает концентрация свободных ионов Са2+ в цитоплазме клетки. Ионы Са2+ активируют фосфатазу кальциневрин, дефосфорилиру- ющую цитоплазматический компонент транскрипционного фактора NF-AT (Nuclear factor of activated T-cells - ядерный фактор активированных Т клеток) (рис. 3.96). Это обусловливает перемещение фактора в ядро, взаимодействие с ядерным компонентом и формирование зрелой формы молекулы NF-AT, способной взаимодействовать с ДНК в промоторных участках генов, вовлеченных в активацию Т-клеток (IL2, IL2R и др.).
Диацилглицерол традиционно рассматривали как фактор, активирующий протеинкиназу С (PKC) - уже не раз упоминавшуюся ранее серин/тре-

Рис. 3.96. Са2+-зависимое звено активации Т-клеток и его блокада циклоспорином А. Зависимый от инозитолтрифосфата сигнальный путь приводит к мобилизации в ядро транскрипицонного фактора NF-AT. Этот путь может быть блокирован циклоспорином А, способным в комплексе с циклофиллином инактивировать фосфатазу кальциневрин, ответственную за дефосфорилирование цитоплазматического фактора NF-AT (что служит условием его миграции в ядро)

ониновую киназу, признаваемую одним из ключевых факторов активации Т-клеток. Однако оказалось, что изоформы РКС, активируемые диацил- глицеролом, не имеют отношения к активации Т-клеток. В ней участвует изоформа 0 РКС, появляющаяся в иммунном синапсе на пике его «зрелости». Ее рекрутирование в иммунный синапс зависит от активности Р13К и Vav (последний фактор связан с цитоскелетом, роль которого в транспорте РКС0 очень важна). Поскольку активация Vav зависит от сигнализации не только через TCR, но и через CD28, а CD28-зависимый путь реализуется с участием PI3K (она ассоциирована с CD28 - см. далее), становится очевидным, что PI3K и Vav представляют различные этапы одного сигнального пути и, таким образом, вовлечение в активацию молекулы РКС0 зависит от костимуляции через CD28. При этом не вызывает сомнений роль в активации РКС0 сигналов, поступающих от TCR, поскольку РКС0 фосфорили- руется (и, следовательно, активируется) киназой Lck. Допускают участие в активации РКС0 и других факторов, в том числе диацилглицерола, но эти влияния второстепенны. Активация PKC0 необходима для предотвращения апоптоза активируемых клеток и включения двух из трех критических транскрипционных факторов, необходимых для экспрессии генов IL2 и IL2R - АР-1 и NF-kB. РКС0-зависимая активация АР-1 реализуется через Rac/JNK-ветвь MAP-каскада (о нем будет сказано далее). Путь, приводящий к активации транскрипционного фактора NF-kB, содержит в качестве

промежуточных звеньев последовательно активируемые (с участием PKC0) факторы CARMA-1, Bcl-10 и MALT-1, IKK. IKK фосфорилирует ингибирующую субъединицу NF-kB - IkK, придавая ей способность к связыванию убиквитина, что предопределяет ее последующую деградацию. При этом освобождается активная субъединица NF-kB, мигрирующая в ядро и выступающая в роли транскрипционного фактора - одного из трех, необходимых для экспрессии генов активации Т-клеток. Транскрипционный фактор NF-kB, играющий ключевую роль при активации клеток врожденного иммунитета, был рассмотрен выше (см. раздел 2.2.4).
Столь же широко при активации клеток используется еще один сигнальный путь, запускаемый при активации Т-лимфоцитов - MAP-каскад, или MAP-модуль (от Mitogen-activated kinases - киназы, активированные мито- геном). Его роль состоит главным образом в индукции транскрипционного фактора АР-1 (димера c-jun/c-fos). Существует 3 ветви этого каскада, приводящие к образованию трех типов MAP-киназ (MAP^ - ERK1/ERK2 (от Extracellular signal-regulated kinases - киназы, регулируемые внеклеточными сигналами), p38 и JNK (от c-Jun NH2-terminal kinases - c-Jun NH2-концевые киназы). Каскады, приводящие к активации MAP-киназ, включаются с участием адапторных белков и низкомолекулярных ГТФаз. Один из адап- торных белков - Grb2 (Growth factor receptor bound protein 2), активируется при взаимодействии с фактором LAT. Активированный Grb2 спонтанно связывается с другим LAT-активированным белком SLP-76 и фактором Sos (от Son of sevenless). Sos представляет фактор замещения гуаниннуклеотидов: он обусловливает замещение ГДФ на ГТФ в составе малых G-белков (т.е. белков, связывающих гуаниннуклеотиды). Поэтому комплекс SLP-76/Grb2/Sos обусловливает активацию G-белка Ras, превращая связанный с ним ГДФ в ГТФ. Ras-ГТФ активирует серин/треониновую киназу Raf (киназу киназы MAP-киназы - МККК). Далее следует каскад реакций: Raf активирует МЕК (киназу MAP-киназы - МКК), а МЕК активирует вышеупомянутые MAP-киназы ERK1 и ERO. Активацию JNK-ветви MAP-каскада инициирует упоминавшийся выше фактор Vav (зависимый от LAT и связанный с активацией цитоскелета, а также РКС0, см. выше). Он вызывает переход ГДФ в ГТФ в комплексе с G-белком Rac (семейство Rho). Rac-ГТФ активирует киназу МЕКК (выступающую в роли МККК), она активирует киназу JNKK (MKK), которая, в свою очередь, активирует MAP-киназу JNK. Третий путь MAP-модуля, приводящий к образованию MAP-киназы р38, также зависит от G-белков семейства Rho. Он аналогичен по общей схеме двум другим путям, но изучен менее детально.
Активация MAP-киназ ERK1/ERK2, JNK и p38 осуществляется путем фосфорилирования остатков треонина и тирозина в мотиве TXY, причем роль Х в трех типах киназ выполняют различные остатки (соответственно Glu, Pro и Gly). Названные MAP-киназы обусловливают формирование транскрипционных факторов, участвующих во многих клеточных процессах. ERK1/ERK2 обусловливает образование транскрипционных факторов АР-1 и Elk-1, JNK - факторов ATF2, Elk-1 и c-Jun (компонент АР-1), p38 - факторов ATF2, Elk-1 и MEF-2C.
Запуск рассмотренных выше сигнальных путей при активации Т-клеток происходит при параллельном связывании TCR и костимуляции через молекулу CD28. Дифференцирование сигнальных путей, включаемых через эти мембранные молекулы, а также расшифровка взаимодействия этих путей до конца не завершены. Однако общая картина проявляется достаточно четко, чтобы в общих чертах понять молекулярные основы костимуляции. При связывании TCR, координированном со связыванием корецептора, происходит изменение конформации комплекса TCR-CD3, CD4 вызывает активацию рецепторных тирозинкиназ Fyn и Lck, а также фосфатазы CD45. Конечный результат «проксимальных» событий - фосфорилирование Z-цепи рецепторного комплекса и передача активационного сигнала на киназу ZAP-70. Далее с участием адапторных белков LAT, SLP-76 и Vav область, вовлеченная в передачу сигнала, существенно расширяется, включая мембранно-связанные киназы, цитоскелет и малые G-белки. Сигнальный путь, приводящий (через активацию PLCyl, образование инозитолтрифосфата и активацию кальциневрина) к мобилизации Са2+ и активации транскрипционного фактора NF-AT, по-видимому, реализуется без прямого участия сигналов, генерируемых при костимуляции. Другие пути в большей или меньшей степени зависят от костимулирующего сигнала.
Наиболее прямое следствие костимуляции через CD28 - активация мембранного фермента PI3K, физически связанного с молекулой CD28. Этот фермент катализирует образование фосфатидилинозитол 4, 5-бифосфата, служащего источником инозитолтрифосфата. Однако это событие напрямую не связано с активацией и может рассматриваться как подготовительное. При активации клетки фосфатидилинозитолтрифосфат активирует Vav - узловой фактор, ответственный за вовлечение в процесс активации цитоскелета и участвующий в рекрутировании и активации протеинкиназы PKC0. Этот фермент важен для функционирования сигнального пути, приводящего к формированию транскрипционных факторов NF-kB и АР-1. В обоих случаях роль PKC0 в наибольшей степени проявляется во включении Rас/JNK-ветви MAP-каскада. Raf/ERK- и Rac/p38-ветви MAP-каскада в меньшей степени зависят от PKC0, а следовательно, от костимуляции. Таким образом, молекулярная основа костимуляции - вовлечение в процесс активации Т-хелпера сигнальных путей, реализуемых с участием трех ключевых факторов - PI3K, фактора Vav и изоформы 0 протеинкиназы С. Из трех ключевых транскрипционных факторов, запускающих гены активации Т-клеток, экспрессия двух (АР-1 и NF-kB) зависит от костимуляции и только для выработки NF-AT непосредственно костимуляция не требуется.
Таким образом, в результате в Т-клетке формируется 3 транскрипционных фактора - NF-AT, NF-kB AP-1. Формирование этих факторов происходит различными путями. Активный NF-AT образуется в результате сборки димера, включающего цитоплазматический и ядерный субкомпоненты NF-AT - NF-ATc и NF-ATn. Если NF-ATn - конститутивный фактор, всегда присутствующий в ядре Т-клетки, NF-ATc должен быть активирован для миграции в ядро, что достигается его дефосфорилированием, катализируемым кальциневрином (см. выше). Транскрипционный фактор NF-kB активируется путем отщепления от комплекса IkB-NF-kB ингибирующей субъединицы IkB. Как уже говорилось выше, это происходит при фосфорилировании IkB киназой IKK, активируемой с участием РКС0. Фосфорилированная субъединица становится доступной для деградации

по убиквитиновому пути. Фактор АР-1 - димер белковых продуктов двух индуцибельных протоонкогенов - c-fos и c-jun. Для экспрессии этих генов и синтеза белков необходимы соответствующие транскрипционные факторы, а именно Elk-1 (для c-fos) и JNK (для c-jun). Как уже было указано выше, Elk-1 и JNK - конечные продукты деятельности различных ветвей MAP-каскада. Синтезируемые de novo белки c-fos и c-jun образуют гомо- и гетеродимеры, формирующие транскрипционный фактор АР-1.
Рассмотренные три фактора (NF-AT, NF-kB и AP-1) нужны для индукции генов активации Т-клеток - в первую очередь IL2 и IL2R. Промоторный участок гена IL2 содержит 9 сайтов связывания транскрипционных факторов (рис. 3.97). Среди них есть 2 участка связывания октомера Oct, не лимитирующего процесс индукции гена. Из трех ключевых транскрипционных факторов NF-kB взаимодействует с промотором в одном сайте, не зависимом от других транскрипционных факторов. Два других фактора - NF-AT и AP-1 - взаимодействуют с промотором как отдельно друг от друга (по 1 сайту связывания), так и в комплексе (3 сайта связывания). Заполнение всех сайтов соответствующими транскрипционными факторами, приводящее к индукции гена, служит конечным результатом передачи сигнала при активации Т-клеток.
Выше были подробно рассмотрены сигнальные пути, участвующие в активации Т-хелперов. Активация цитотоксических Т-клеток осуществляется по сходным механизмам.
3.5.2.2. Проявления активации Т-клеток
Активация CD4+ Т-клеток (как и любых Т-лимфоцитов) приводит к экспрессии большого числа генов, среди которых наибольшую роль в реализации основных эффекторных событий играют гены IL2 и IL2R, кодирующие соответственно цитокин IL-2 и a-цепь его рецептора. Экспрессия гена IL2 происходит примерно через 1 ч после получения стимулирующего сигнала. Секрецию белка IL-2 стимулированными Т-клетками in vitro выявляют через 3-4 ч; она достигает пика через 8-12 ч и прекращается через 24 ч. In vivo секреция IL-2 начинается через 1-3 сут после введения антигена

Рис. 3.98. Временная динамика экспрессии молекул активации Т-клеток. На графи
ке представлены сроки экспрессии ключевых молекул активации после стимуляции Т-клеток

(иммунизации) и сохраняется в течение 7-12 сут. Экспрессия a-цепи рецептора IL-2 происходит несколько позже и продолжается дольше - in vitro ее выявляют через 4 ч после стимуляции; максимума она достигает через 2-3 сут и прекращается через 5 сут (рис. 3.98).
Одновременно с геном IL2 в кратчайшие сроки после действия стимулятора (в физиологических условиях - антигенного комплекса пептид-MHC) экспрессируются гены с-Myc и N-Myc, называемые ранними активационными генами. Они участвуют в подготовке клеток к митозу. Через 2-3 ч на поверхности Т-клетки появляется CD69 - самый ранний активационный антиген, частично мобилизуемый из внутриклеточных депо, а частично экспрессируемый de novo. Его экспрессия продолжается немногим более суток. Вскоре после CD69 на поверхности клетки появляется другой ранний маркер активации - CD25, представляющий уже упомянутую a-цепь рецептора для IL-2. Несколько раньше выявляют экспрессию ряда цитоки- новых генов и синтез ограниченных количеств соответствующих цитокинов (IFNy, IL-4, IL-5, IL-6).
Следующие проявления активации наблюдают через сутки после действия стимулятора, когда экспрессируется молекула рецептора для транс- феррина (CD71). Этот фактор играет важную роль в пролиферации, поскольку для ее осуществления необходимы ионы железа. В последующие дни (3-6 сут) экспрессируются молекулы MHC-II, относимые к поздним маркерам активации Т-клеток, а затем - р1-интегрины, обозначаемые как очень поздние активационные антигены - VLA (Very late activation antigens), и секретируются хемокины. Эти поздние проявления активации клеток совмещаются с пролиферативным процессом.

Дендритные клетки – часть иммунной системы организма. Их сооткрывателем и открывателем ряда их ключевых функций был Ральф Штейнман , за что в 2011 году он получил Нобелевскую премию. По воле случая получилось так, что доктор Штейнман был единственным, кому Нобелевская премия досталась посмертно (сама по себе премия присуждается живым людям). Казус заключался в том, что смерть господина Штейнмана и объявление о присуждении ему премии произошли в один день (в пятницу), но о смерти было объявлено только в понедельник. Комитет Нобелевской премии решил, что технически на момент объявления победителя доктор Штейнман был жив, и ситуацию не стали «переигрывать».

Дендритные клетки (Dendritic cells, DCs) получили свое название за внешнюю схожесть с дендритами нейронов. Они являются частью врожденного иммунитета и играют важную роль в активации адаптивного иммунитета.

Цель заметки – раскрыть базовые принципы активации Т-клеток дендритными клетками и познакомить читателя с необходимой терминологией.

• Врожденная и адаптивная иммунная система;
• Общие принципы функционирования врожденной иммунной системы;
• Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) и pattern recognition receptors (PRRs);
  • Небольшой фокус на дендритных клетках и интерфероне I типа.
• Коротко о разных видах клеток адаптивной иммунной системы;
• Дендритные клетки и их функции:
  • Antigen presenting cells и активация Т-клеток;
  • MHC-белки и пептидные «сигнатуры» микробов;
  • Разница MHC I и MHC II;
  • Активация дендритных клеток молекулярными паттернами микробов;
  • CCR7 (рецептор хемокина 7) и миграция в дендритных клеток в лимфоузлы;
  • Циркуляция наивных Т-клеток и попадание их в лимфоузлы;
  • Презентация антигена дендритными клетками и принцип «двойного рукопожатия»;
  • Активация, экспансия и деактивация Т-клеток.

Рассказ не хочется ограничивать исключительно нюансами функций DCs. Хочется, чтобы эта информация накладывалась на какую-то базу о работе иммунной системы. При этом попытки охватить все и сразу не будет. Комплиментарная система, подробности создания и работы антигенов, активация B-клеток и многого-много другого в заметке не будет.

Врожденная иммунная система

Innate immune system (врожденный иммунитет) – мгновенно реагирует на заранее определенное и небольшое количество патогенных паттернов;

Adaptive immune system (адаптивный иммунитет) с задержкой реагирует, но на любое антитело. В последствии запоминая антитело, и в последующие разы реактивно на него реагируя.

Основной клеточный состав врожденной иммунной системы:

• Циркулирующие в крови клетки:
  • Нейтрофилы, фагоцитируют бактерии, но быстро погибают (в течение часа), секретируют цитокины итд;
  • Моноциты, преобразовываются в макрофаги при попадании в ткани;
• Дозорные клетки (sentinel cells):
  • Маркофаги, фагоцитоз микробов и мертвых клеток (в основном нейтрофилов), секретируют цитокины, несколько месяцев жизни итд;
  • Тучные клетки (mast cells), секретируют цитокины, гистамины итд;
  • Дендритные клетки, запускают антивирусный ответ, активируют Т клетки итд.

Дозорные клетки находятся в тканях и реагируют на микробы после пересечения последними эпителиальных барьеров кожи и кишечника.

Циркулирующие клетки иммунной системы находятся в крови. И при воспалении попадают в нужные ткани.

Примерный порядок активации врожденного иммунитета:

• Микробы пересекают эпителиальные барьеры;
• Рецепторы дозорных клеток опознают «непрошенных гостей»;
• Дозорные клетки секретируют провоспалительные цитокины;
• Цитокины связывают на рецепторах эндотелия;
• Что активирует молекулы адгезии внутри сосудов;
• Различные молекулы адгезии с разной аффинитивностью связываются с соответствующими лигандами на поверхности циркулирующих иммунных клеток:
  • Например, e-selectin связывается с низкой аффинитивностью с лингадом e-selectin на нейтрофилах, что затормаживает их движение;
  • I-CAM связывается с высокой аффинтивностью с LFA-1 белком иммунной клетки, что останавливает иммунную клетку;
• После полной остановки иммунные клетки просачиваются с воспаленную ткань и начинают все доступными им способами уничтожать микробы;
• Первыми приходят нейтрофилы, фагоцитируют бактерии и через пару часов погибают сами; За ними приходят моноциты, превращаются в макрофаги и «подъедают» остатки трупов как микробов, так и нейтрофилов.

Остается вопрос: как дозорные клетки врожденного иммунитета опознают микробы?

PAMPs (Pathogen-associated molecular patterns) – паттерны молекулярных патогенов;

PPRs (Pattern recognition receptors) – рецепторы, опознающие паттеры.PAMPs:

• Вирусные (находятся внутри клетки):
  • Односпиральные РНК;
  • Двуспиральные РНК
• Бактериальные (в большей степени на поверхности клетки):
  • Паттерны Грам-отрицательные паттерны:
    • Липополисахариды (LPS) клеточной стенки;
    • Флагеллины («жгутики» для перемещения);
  • Паттерны Грам-положительных бактерий:
    • Флагеллины;
    • Тейхоивые кислоты;
    • Пептидогликаны

Бактерии уничтожаются при помощи фагоцитоза и разрушения их клеточной стенки.

Цепочка будет такой: бактерия связывается с PPRs на поверхности клетки (так называемые TLRs toll like receptors) → димеризация рецепторов и запуск цепочки внутриклеточных сигналов ˧ деактивация ингибитора Nf-Kb → выраженность транскрипторного фактора Nf-Kb → клеточные изменения, в частности секреция цитокинов TNFα и IL-1.

Плазмоцитоидные дендритные клетки и антивирусный ответ

С вирусами ситуация чуть интересней, и тут к нам возвращаются дендритные клетки.

Дендритные клетки реагируют на вирусные PAMPs секретированием интерферонов 1 типа. INF type 1 приводят клетки (например, эпителия) в противо-вирусное состояние. Которое заключается в большей подверженности апоптозу зараженными клетками, выраженности белков/ферментов, которые мешают вирусу размножаться и которые могут наносить урон ДНК/РНК вируса.

Сами клетки в противовирусном состоянии также способны секретировать INF type 1.

Дендритные клетки

Необходимые вводные закончились, пора приступить к antigen presenting cells. К антиген презентующим клеткам относятся дендритные клетки, макрофаги и B-клетки.

В дальнейшем речь будет идти о том, как DCs активируют Т-клетки адаптивной иммунной системы.

Т-клетки, MHC I и MHCII

Т клетки своими рецепторами могут воспринимать только пептиды, представленные им на MHC белках антиген презентующих клеток.

MHC II

• Отвечает за бактерии;
• Дендритные клетки интернализируют бактерии, уничтожают их в лизосомах, в итоге мы получаем пептидную «сигнатуру» бактерии;
• MHC с пептидом отправляется к мембране;
• MHC II связываются с рецепторами CD4+ клеток (T helpers, которые активируют B-клетки и клетки врожденной иммунной системы;
• MHC II есть у антиген презентующих клеток.

MHC I

• Отвечает за вирусы (тему опухолей пропустим);
• Вирусный белок проходит юбиквинацию и становится доступных протеазам;
• Протеаза «расщепляет» вирусный белок до пептидов;
• Вирусный пептид с помощью транспортера TAP попадает в эндоплазматический ретикулум, откуда с MHC I комплексом попадает на мембрану;
• MHC I активирует CD8+ клетки (цитотоксичные T клетки, которые уничтожают зараженные вирусы;
• MHC I есть у большинства клеток, что объясняется особенностью вирусов.

Дендритные клетки. Активация и миграция в лимфоузлы

Для активации дендритных клеток должно произойти 2 события:

• MHC белок с пептидом микроба на поверхности клетки (значит он был так или иначе интернализирован и расщеплен до пептидов);
• PAMP рецепторы дендритных клеток должны быть активированными микробами;

При выполнении двух этих условий дендритные клетки выражают CD80/CD86 (подробнее чуть позже) и CCR7 (хемокин рецептор 7), выраженность которого приводит к тому, что DCs мигрируют в лимфососуды и по ним попадают во вторичные лимфо-органы. В частности, в лифмоузлы, где в межмембранном пространстве встречаются с Т-клетками.

Дендритные клетки активируют Т клетки

Т-лимфоциты путешествуют по крови по попадают с мемфоликулярное пространоство лимфоузлов при помощи кровотока и так называемых High endothelial venules (HEV).

Дело в том, что Т-клеток, аффинитивных определенному антигену, очень немного. Поэтому они путешествуют по организму, заходя ненадолго в лимфоузлы, куда активированные дендритные клетки попадают из тканей.

Для активации Т-клеток должно пройти 2 сигнала:

Сигнал 1. Антиген должен связаться с рецептором Т-клетки (нужна Т клетка с необходимой аффинитивностью рецептора;

Сигнал 2. Костимулирующие молекулы должны соединиться. Это B7-1 (CD80) и B7-2 (СD86) на стороне DCs и CD-28 на стороне Т-клеток.

Сигнал 1 без сигнала 2 приведет к апоптозу или анергии (угасание активной иммунной функции) Т-клетки.

После активация Т клетки проходят clonal expansion, активно делятся, их становятся десятки тысяч в случае с CD4+ и даже сотни тысяч в случае CD8+. Плюс Т-клетки после активации приобретают некоторые полезные фукнции.

Я опущу вопрос активации B-клеток Т-клетками, вопрос более глубокой функции T helpers и T killers. Остановлюсь только на активации Т клеток. В ткани они попадают примерно также, как циркулирующие в кроки клетки врожденной иммунной системы (см выше).

Деактивация Т-клеток

Любое воспаление (особенно цитотоксичное) чревато последствиями для организма. И этот процесс на уметь «тормозить».

В лимфоузлах это за это отвечает белок CTLA4 на Т-клетках, который связывается вместо CD28 с B7-1/B7-2. Это приводит к тому, что во время активации у нас будет только сигнал 1 и Т клетка будет неактивной.

Ткани (и опухоли) выражают PD-1 лиганд (PD-1, programmed death), который связывается с PD-1 белком Т-клеток, что приводит к их exhaustion (истощению), то есть деактивации.

Моноклональные антитела, подавляющие функции CTLA-4 и PD-1, одно из последних слов в борьбе с раковыми заболеваниями.

Выводы:

• Дендритные клетки активируются двумя сигналами:
  • MHC белком на мембране, на котором будет пептидный антиген;
  • PAMPs микробов связывается с рецепторами DCs;
• Активированные дендритные клетки выражают CCR7, что позволяет им мигрировать через лимфо-сосуды в лимфоузлы и «искать» в междфоликулярном пространстве нужную Т-клетку;
• Активация Т-клеток включает в себя 2 сигнала:
  • Сигнал 1 MHC с пептидом (антигеном) связываются с нужным TCR (T cell receptor);
  • Сигнал 2, костимуляция CD86/CD80 DCs с CD28 Т-клеток;
• При наличии только сигнала 1 Т-клетки подвергаются апоптозу или анергии;
• После активации начинается экспансия и дифференциация Т-клеток, которая является одним из компонентов ответа иммунной системы.

Источники:

1. Торможение лейкоцитов молекулами адгезии [видео];

P.S. Это было писать скучно, в виду пересказа без моего вклада, но необходимо для ряда последующих заметок.

Словарь по итогам заметки:

• Врожденная иммунная система:
  • Дозорные клетки (тучные, макрофаги, дендритные – это только основные, есть и другие);
  • Циркулирующие клетки (моноциты, нейтрофилы);
  • Также врожденная иммунная система включает в себя барьеры (эпителий, муцин), белки и молекулы (комплименты, агглутинины);
• Адаптивная иммунная система: B-клетки, T-помощники, цитотоксичные Т-клетки;
• Дендритные клетки:
  • MHC I,
  • MHC II
  • B7-1 (CD80)
  • B7-2 (CD86)
• Т-клетки:
  • CD28
  • CTLA4
• Клональная селекция;
• Клональная экспансия
• Антиген-презентующие клетки (DCs, макрофаги, B-клетки);
• Анергия

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Ученые объединили методы иммунотерапии, цитотерапии и генотерапии для перепрограммирования Т-лимфоцитов в потенциальных «убийц» раковых клеток. Но и этого оказалось недостаточно - следующим шагом стало создание молекулярного «выключателя», с помощью которого можно регулировать время и силу действия активированных Т-клеток. Инновационный метод закладывает основу для резкого сокращения серьезных (а иногда и смертельных) побочных эффектов, вызванных терапией с использованием модифицированных Т-клеток.

Обратите внимание!

Спонсором номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» является фонд «Наука за продление жизни ». Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon .

Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science .

Медицина перешла на новый уровень: клетки стали живым лекарством

В последнее время в терапии опухолевых заболеваний особое внимание уделяется адоптивной иммуноцитотерапии (от англ. adoptive - приемный). При этом часть клеток иммунной системы пациента искусственно «натравливают» на опухолевые клетки. Суть метода состоит в том, чтобы отобрать у пациента необходимые иммунные клетки, обработать их - например, иммунными цитокинами (небольшими белками, выполняющими функции регуляторов деления и дифференцировки специфических иммунных клеток), - а затем вернуть в организм уже активированные клетки, которые и будут помогать бороться с опухолями* (рис. 1).

* - Эта тема является одной из самых горячих направлений клинической иммунологии - см. статью «Хороший, плохой, злой, или Как разозлить лимфоциты и уничтожить опухоль » . - Ред.

Впервые метод адоптивной иммуноцитотерапии был описан еще в 1988 году - у пациентов с метастатической меланомой (то есть раком кожи на четвертой стадии) наблюдалась регрессия заболевания при терапии с помощью их TIL-клеток (лимфоцитов, инфильтрующих опухоль) . В настоящее время терапия метастатической меланомы на основе TIL-клеток является наиболее эффективным способом лечения данного заболевания, поскольку регрессия опухоли наблюдается у половины пациентов .

Существует несколько вариантов клеток, которые используются в адоптивной иммунотерапии; из них три используются при терапии опухолевых заболеваний: уже знакомые нам TIL-клетки (лимфоциты, инфильтрующие опухоль), LAC-клетки (лимфокин-активированные киллеры) и CIK-клетки (цитокин-индуцированные киллеры). На самом деле собственные Т-клетки организма тоже стараются бороться с опухолевыми клетками, только зачастую опухолевые клетки им «не по зубам». Не то, чтобы совсем - ведь существует иммунный надзор, осуществляемый Т-клетками и естественными киллерами (NK-клетками), с помощью которых иммунная система старается защититься от опухолей, - однако это вовсе не стопроцентная защита. Однако случается, что иммунный надзор не всегда достаточно силен, чтоб предотвратить развитие опухолей: так, при длительном применении иммунодепрессантов после трансплантаций органов повышается частота развития многих опухолей .

Необходима система наведения

Несмотря на сложность получения модифицированных клеток, а также сопутствующий риск возникновения серьезных побочных эффектов, все же главной проблемой метода иммуноцитотерапии является отсутствие способов прицельной доставки вводимых модифицированных иммунных клеток в опухоль. Раковые клетки часто делаются практически «невидимыми» для иммунной системы, и они образуют микросреду, которая подавляет активность и миграцию Т-клеток . Для того, чтобы сбросить мантию-невидимку с опухолевых клеток, Т-лимфоциты надо не только активировать, но и придать им способность прицельно узнавать опухолевые клетки. Т-клетки могут быть перепрограммированы методами генной инженерии путем введения генов, кодирующих рецепторы к опухолевым антигенам (TAA, tumour-associated аntigens) - оснащения собственной «системой наведения». Также можно заодно ввести гены для придания Т-клеткам устойчивости к иммуносупрессии для увеличения выживаемости или облегчения проникновения сконструированных Т-клеток в опухоль. В итоге, могут быть получены высокоактивные «наемные убийцы» раковых клеток .

Для получения эффективных «убийц» Т-лимфоциты модифицируют путем оснащения их искусственными химерными антигенными рецепторами (CAR, chimeric antigen receptors). Рецепторы химерные, поскольку одна часть (распознающая) была «позаимствована» у моноклональных антител, а часть, передающая сигнал, - у Т-клеточного рецептора (ТCR). В качестве внеклеточной «распознающей» части обычно служат вариабельные домены тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов необходимой специфичности (scFv), которые образуют специфичный к опухолевым клеткам антиген-связывающий участок (рис. 2).

Рисунок 2. Структура химерного антигенного рецептора (CAR). CAR состоит из внеклеточного домена (одноцепочечного вариабельного фрагмента антитела (scFv)), соединенного с помощью цепей и трансмембранных доменов с цитоплазматической сигнальной областью. Гены, кодирующие scFv, получены из В-клеток, продуцирующих антитела, специфичные к опухолевому антигену. CAR существует в виде димера, и распознавание опухоли происходит напрямую (без участия MHC). Рисунок из .

Все новое - это хорошо забытое старое. Первые Т-клетки с химерным антигенным рецептором были получены командой ученых под руководством профессора Эсхара (Zelig Eshhar ); результаты работы были опубликованы еще в 1989 году . Эсхар понял, что, обладая данной техникой, Т-клетки можно запрограммировать на нацеленную атаку.

Однако с момента обнаружения химерных антигенных рецепторов до внедрения технологии в практику прошло больше 20 лет. За это время были улучшены химерные антигенные рецепторы - были созданы CAR 2-го поколения, в которые был внесен дополнительный сигнальный домен костимулирующей молекулы, который позволил улучшить активацию Т-клеток и их распространение. В CAR 3-го поколения был добавлен еще один сигнальный домен, что в конечном итоге повысило уровни выживания и размножения модифицированных Т-клеток (рис. 3). В конечном итоге были улучшены способность к «выслеживанию» опухолевых клеток, а также уменьшены побочные эффекты.

Рисунок 4. Бутылка с питательной средой для Т-клеток , которые после введения в них нового рецептора выращивают около 10 дней до достижения ими количества в несколько миллиардов. Тогда они могут быть введены в вены пациента. Рисунок из .

Первые клинические испытания генетически модифицированных Т-лимфоцитов, несущих химерные антигенные рецепторы, прошли в 2012 году. Они выпали на долю девочки по имени Эмили, больной острой лимфобластной лейкемией. После того, как генетически модифицированные Т-клетки были обратно введены девочке, ее состояние резко ухудшилось, и она провела несколько недель в отделении интенсивной терапии на искусственной вентиляции легких. В какой-то момент жизнь Эмили висела на волоске, но в итоге девочка поправилась, и уже три года в ее организме врачи не находят даже единичных раковых клеток .

Побочные эффекты новой терапии

Несмотря на то, что иммуноцитотерапия Т-клетками с CAR является прорывом в области лечения опухолевых заболеваний, есть еще ряд опасностей, которые могут поджидать за углом. Доктор Карл Джун (Carl June ) из университета Пенсильвании был одним из первых, кто опубликовал успешные результаты лечения модифицированными Т-клетками, сравнил то, что происходит внутри тела пациента с «серийным убийством» и «массовым убийством». Когда миллиарды Т-клеток, которые были введены в организм, поделятся, то они смогут обнаружить и убить несколько фунтов опухоли. Но в этом тоже немало риска - многие пациенты страдают от синдрома высвобождения цитокинов (цитокинового шторма) - при борьбе Т-клетки с опухолевой клеткой высвобождается большое количество молекул цитокинов, что представляет угрозу для самого организма. Так, семь пациентов умерло вследствие этого синдрома .

Побочные эффекты связаны с мощной иммунной активностью модифицированных Т-клеток. Одним из камней преткновения является риск высокой токсичности, не позволяющий ввести подобное лечение на регулярной основе. «Т-клетки - действительно мощные создания» , - говорит профессор Венделл Лим (Wendell Lim ), заведующий отделом Департамента клеточной и молекулярной фармакологии Калифорнийского университета. - «Будучи активированными, они могут вызвать смерть. Нам необходима система удаленного контроля, которая сохранит силу этих модифицированных Т-клеток, и позволит специфично „общаться“ с ними и управлять Т-клетками, находящимися в организме» .

Т-клетки взяли под контроль

Ученые из Калифорнийского университета в Сан-Франциско создали молекулярный «включатель», с помощью которого можно управлять действиями генноинженерных Т-лимфоцитов. Как и обыкновенные Т-клетки, несущие CAR, новые Т-клетки с «включателем» будут взаимодействовать с опухолевыми клетками, но не будут переходить «в атаку», пока не будет введен специальный препарат. Данный препарат является своеобразным «химическим мостиком» внутри Т-клеток: он запускает иммунные реакции, «включает» их, переводя в активное состояние. Когда препарат перестает циркулировать в крови, Т-клетки снова переходят в «выключенное» состояние (рис. 5).

Рисунок 5. Титруемый контроль генноинженерных Т-клеток с помощью включаемого химерного антигенного рецептора. С обычным CAR Т-клетки активируются при соединении с клеткой-мишенью, при этом из-за очень сильного иммунного ответа есть риск высокой токсичности. «Включаемый» CAR требует небольшую стимулирующую молекулу для запуска терапевтической функции. Величину ответа (например, «убийства» клеток-мишеней) можно титровать, тем самым уменьшая токсичность при уменьшении количества небольшой стимулирующей молекулы. Рисунок из .

Внедрение «пульта управления» в Т-клетку с химерным антигенным рецептором - это пример простой и эффективной стратегии совмещения собственных и автономных решений клетки (например, обнаружение сигналов болезни) с контролируемыми пользователем из вне. Перегруппировка и расщепление основных частей CAR обеспечивает возможность «включения» и «выключения» химерных антигенных рецепторов. Данная работа также подчеркивает важность разработки оптимизированных биоинертных «пультов управления», таких как небольшие молекулы и свет, вместе с их клеточными компонентами реагирования, в целях повышения точности контролируемой терапии .

Таким образом, правильно дозируя препарат, можно управлять уровнем иммунной активности модифицированных Т-клеток. В частности, благодаря данной технологии можно снизить отрицательные последствия синдрома высвобождения цитокинов. Также иногда нормальные клетки экспрессируют небольшие количества белков, которые являются мишенью для Т-клеток с CAR. Поскольку модифицированные Т-клетки вводят в кровяное русло и они проходят через сердце и легкие, ткани этих органов могут быть повреждены прежде, чем Т-клетки достигнут своих намеченных целей в других частях тела. А с новой технологией Т-клетки будут в «выключенном» состоянии, пока не достигнут цели .

Иммунотерапия с помощью Т-клеток с CAR успешна против рака крови, но, когда дело доходит до твердых опухолей, которые образуются в толстой кишке, молочных железах, мозге и других тканях, модифицированные Т-клетки до сих пор не показывают высокой эффективности. Возможно, метод дистанционного управления Т-клетками позволит разработать более мощные версии химерных антигенных рецепторов, которые позволят Т-клеткам поражать твердые опухоли, при этом не обладая серьезными побочными эффектами.

Литература

1. Хороший, плохой, злой, или Как разозлить лимфоциты и уничтожить опухоль ;
2. Rosenberg S.A., Packard B.S., Aebersold P.M., Solomon D., Topalian S.L., Toy S.T. et al. (1988). Use of tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin-2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma. A preliminary report . ;
3. Regalado A. (2015). Biotech’s coming cancer cure . MIT Technology Review ;
4. Farley P. (2015). ‘Remote control’ of immune cells opens door to safer, more precise cancer therapies . University of California San Francisco ;
5. Wu C., Roybal K.T., Puchner E.M., Onuffer J., Lim W.A. (2015). Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor . Science . 350 , aab4077..

Тимусе T-лимфоциты дифференцируются, приобретая Т-клеточные рецепторы (англ. TCR) и различные ко-рецепторы (поверхностные маркеры). Играют важную роль в приобретённом иммунном ответе. Обеспечивают распознавание и уничтожение клеток, несущих чужеродные антигены, усиливают действие моноцитов, NK-клеток, а также принимают участие в переключении изотипов иммуноглобулинов (в начале иммунного ответа B-клетки синтезируют IgM, позже переключаются на продукцию IgG, IgE, IgA).

• 1 Типы Т-лимфоцитов
  • 1.1 Т-хелперы
  • 1.2 Т-киллеры
  • 1.3 Т-супрессоры
• 2 Дифференциация в тимусе
  • 2.1 β-селекция
  • 2.2 Позитивная селекция
  • 2.3 Негативная селекция
• 3 Активация
• 4 Примечания

Типы Т-лимфоцитов

Т-клеточные рецепторы (англ. T-Cell Receptor (TCR)) являются основными поверхностными белковыми комплексами Т-лимфоцитов, ответственными за распознавание процессированных антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (англ. Major Histocompatibility Complex (MHC)) на поверхности антигенпрезентирующих клеток. Т-клеточный рецептор связан с другим полипептидным мембранным комплексом, CD3. функции CD3 комплекса входит передача сигналов в клетку, а также стабилизация Т-клеточного рецептора на поверхности мембраны. Т-клеточный рецептор может ассоциироваться с другими поверхностными белками, TCR корецепторами. зависимости от корецептора и выполняемых функций различают два основных типа Т клеток.

Т-хелперы

Т-хелперы (от англ. helper - помощник) - Т-лимфоциты, главной функцией которых является усиление адаптивного иммунного ответа. Активируют Т-киллеры, B-лимфоциты, моноциты, NK-клетки при прямом контакте, а также гуморально, выделяя цитокины. Основным признаком Т-хелперов служит наличие на поверхности клетки молекулы корецептора CD4. Т-хелперы распознают антигены при взаимодействии их Т-клеточного рецептора с антигеном, связанным с молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса (англ. Major Histocompatibility Complex II (MHC-II)).

Т-киллеры

Т-хелперы и Т-киллеры образуют группу эффекторных Т-лимфоцитов , непосредственно ответственных за иммунный ответ. то же время существует другая группа клеток, регуляторные Т-лимфоциты , функция которых заключается в регулировании активности эффекторных Т-лимфоцитов. Модулируя силу и продолжительность иммунного ответа через регуляцию активности Т-эффекторных клеток, регуляторные Т-клетки поддерживают толерантность к собственным антигенам организма и предотвращают развитие аутоиммунных заболеваний. Существуют несколько механизмов супрессии: прямой, при непосредственном контакте между клетками, и дистантный, осуществляющийся на расстоянии - например, через растворимые цитокины.

Т-супрессоры

γδ Т-лимфоциты представляют собой небольшую популяцию клеток с видоизмененным Т-клеточным рецептором. отличие от большинства других Т-клеток, рецептор которых образован двумя α и β субъединицами, Т-клеточный рецептор γδ лимфоцитов образован γ и δ субъединицами. Данные субъединицы не взаимодействуют с пептидными антигенами презентированными MHC комплексами. Предполагается, что γδ Т-лимфоциты участвуют в узнавании липидных антигенов.

Дифференциация в тимусе

Все Т-клетки берут свое начало от гемопоэтических стволовых клеток красного костного мозга, которые мигрируют в тимус и дифференциируются в незрелые тимоциты . Тимус создает микросреду, необходимую для развития полностью функционального репертуара Т-клеток, который является МНС-ограниченным и толерантным к самому себе.

Дифференциация тимоцитов разделяется на разные стадии в зависимости от экспрессии различных поверхностных маркеров (антигенов). На самой ранней стадии, тимоциты не экспрессируют CD4 и CD8 корецепторов, и поэтому классифицируются как двойные негативные (англ. Double Negative (DN)) (CD4-CD8-). На следующей стадии тимоциты экспрессируют оба корецептора и называются двойными позитивными (англ. Double Positive (DP)) (СD4+CD8+). Наконец на финальной стадии происходит селекция клеток, которые экспрессируют только один из корецепторов (англ. Single Positive (SP)): или (CD4+), или (CD8+).

Раннюю стадию можно разделить на несколько подстадий. Так, на подстадии DN1 (англ. Double Negative 1), тимоциты имеют следующую комбинацию маркеров: CD44+CD25-CD117+. Клетки с данной комбинацией маркеров ещё называют ранними лимфоидными предшественниками (англ. Early Lymphoid Progenitors (ELP)). Прогрессируя в своей дифференциации, ELP клетки активно делятся и окончательно теряют способность трансформироваться в другие типы клеток (например В-лимфоциты или миелоидные клетки). Переходя на подстадию DN2 (англ. Double Negative 2), тимоциты экспрессируют CD44+CD25+CD117+ и становятся ранними Т-клеточными предшественниками (англ. Early T-cell Progenitors (ETP)). течение DN3 подстадии (англ. Double Negative 3), ETP клетки имеют комбинацию CD44-CD25+ и вступают в процесс β-селекции.

β-селекция

Гены Т-клеточного рецептора состоят из повторяющихся сегментов, принадлежащих к трем классам: V (англ. variable), D (англ. diversity) и J (англ. joining). процессе соматической рекомбинации генные сегменты, по одному из каждого класса, соединяются вместе (V(D)J рекомбинация). Объединённая последовательность сегментов V(D)J приводит к появлению уникальных последовательностей для вариабельных доменов каждой из цепей рецептора. Случайный характер образования последовательностей вариабельных доменов позволяет генерировать Т-клетки, способные распознавать большое количество различных антигенов, и, как следствие, обеспечивать более эффективную защиту против быстро эволюционироющих патогенов. Однако этот же механизм зачастую приводит к образованию нефункциональных субъединиц Т-клеточного рецептора. Гены, кодирующие TCR-β субъединицу рецептора, первыми подвергаются рекомбинации в DN3 клетках. Чтобы исключить возможность образования нефункционального пептида, TCR-β субъединица образует комплекс с инвариабельной пре-TCR-α субъединицей, формируя т. н. пре-TCR рецептор. Клетки, неспособные образовывать функциональный пре-TCR рецептор, погибают в результате апоптоза. Тимоциты, успешно прошедшие β-селекцию, переходят на подстадию DN4 (CD44-CD25-) и подвергаются процессу позитивной селекции .

Позитивная селекция

Клетки, экспрессирующие на своей поверхности пре-TCR рецептор все ещё не являются иммунокомпетентными, так как не способны связываться с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC). Для узнавания молекул MHC TCR-рецептором необходимо наличие CD4 и CD8 корецепторов на поверхности тимоцитов. Образование комплекса между пре-TCR рецептором и CD3 корецептором приводит к ингибированию перестроек генов β субъединицы и в то же время вызывает активацию экспрессии генов CD4 и CD8. Таким образом тимоциты становятся двойными позитивными (DP) (CD4+CD8+). DP тимоциты активно мигрируют в корковое вещество тимуса где происходит их взаимодействие с клетками кортикального эпителия, экспрессирующими оба MHC комплекса (MHC-I и MHC-II). Клетки, неспособные взаимодействовать с MHC комплексами кортикального эпителия подвергаются апоптозу, в то время как клетки успешно прошедшие такое взаимодействие, начинают активно делиться.

Негативная селекция

Тимоциты, прошедшие позитивную селекцию, начинают мигрировать к кортико-медуллярной границе тимуса. Попадая в медуллу, тимоциты взаимодействуют с собственными антигенами организма презентированными на MHC комплексах медуллярных тимических эпителиальных клеток (мТЭК). Тимоциты, активно взаимодействующие с собственными антигенами подвергаются апоптозу. Негативная селекция предотвращает появление само-активирующихся Т-клеток способных вызывать аутоиммунные заболевания, являясь важным элементом иммунологической толерантности организма.

Активация

Т-лимфоциты, успешно прошедшие позитивную и негативную селекцию в тимусе, попавшие на периферию организма, но не имевшие контакта с антигеном называются наивными Т-клетками (англ. Naive T cells). Основной функцией наивных Т клеток является реакция на патогены, прежде не известные иммунной системе организма. После того как наивные Т клетки распознают антиген, они становятся активированными. Активированные клетки начинают активно делиться образуя множество клонов. Некоторые из этих клонов превращаются в эффекторные Т- клетки , которые выполняют функции специфичные для данного типа лимфоцита (например выделяют цитокины в случае Т-хелперов или же лизируют пораженные клетки в случае Т-киллеров). Другая половина активированных клеток трансформируется в Т-клетки памяти . Клетки памяти сохраняются в неактивной форме после первичного контакта с антигеном до тех пор, пока не наступает повторное взаимодействие с тем же антигеном. Таким образом, Т-клетки памяти хранят информацию о ранее действовавших антигенах и формируют вторичный иммунный ответ, осуществляющийся в более короткие сроки, чем первичный.

Взаимодействия Т-клеточного рецептора и корецепторов (СD4, CD8) с главным комплексом гистосовместимости важно для успешной активации наивных Т-клеток, однако само по себе не достаточно для дифференциации в эффекторные клетки. Для последующей пролиферации активированных клеток необходимо взаимодействие т. н. костимулирующих молекул. Для Т-хелперов такими молекулами являются CD28 рецептор на поверхности Т-клетки и иммуноглобулин B7 на поверхности антигенпрезентирующей клетки.

Примечания

1. Murphy K., Travers P., Walport M. Janeway"s Immunobiology. - New York: Garland Science, 2011. - 888 p. - ISBN 0-8153-4123-7.
2. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology of the Cell. - New York: Garland Science, 2002. - 1367 p. - ISBN 0-8153-3218-1.
3. Holtmeier W., Kabelitz D. Gammadelta T cells link innate and adaptive immune responses // Chemical immunology and allergy. - 2005. - Vol. 86. - P. 151–83. - ISBN 978-3-8055-7862-2. - DOI:10.1159/000086659 - PMID 15976493.
4. Schwarz B. A., Bhandoola A. Trafficking from the bone marrow to the thymus: a prerequisite for thymopoiesis // Immunol. Rev.. - 2006. - Vol. 209. - P. 47–57. - DOI:10.1111/j.0105-2896.2006.00350.x - PMID 16448533.
5. Sleckman B. P. Lymphocyte antigen receptor gene assembly: multiple layers of regulation // Immunol Res. - 2005. - Vol. 32. - P. 153-8.

Кровь
Кроветворение	Костный мозг человека Эритропоэз Лейкопоэз
Компоненты	Плазма Эритроциты Гематокрит Тромбоциты Лейкоциты: Гранулоциты (Нейтрофилы Эозинофилы Базофилы) Агранулоциты (Лимфоциты (T- B- NK-) Моноцит)
Биохимия	Группа крови Резус-фактор Буферные системы (Ацидоз Алкалоз) Сыворотка Гликемия (Гипер- Гипо-)
Заболевания	Анемия Лейкоз Коагулопатия (Гемофилия Болезнь Виллебранда) Гемобластозы
См. также	Гематология Онкогематология

t лимфоциты выше, t лимфоциты норма, t лимфоциты повышены, t лимфоциты понижены

T-лимфоциты Информацию О