Спонтанная мутация
Мутации.
Вирусам, как и всем живым организмам, свойственны наследственность и изменчивость. На раннем этапе исследования генетики вирусов животных в основном заключались в сборе и последующей генетической и физиологической характеризации вирусных мутантов. В последнее время вирусные мутанты стали использовать в качестве специфических инструментов для исследования генетических и биохимических событий, происходящих в зараженной клетке. Работы такого рода с вирусами животных в целом запаздывали по сравнению с аналогичными работами на прокариотических системах.
Некоторые вирусы дают значительную долю мутантов при пассировании в отсутствие каких-либо известных мутагенов. Эти спонтанные мутации накапливаются в геномах вирусов и приводят к изменчивости фенотипа, которая является объектом селективного давления в ходе эволюции вируса.
Скорость спонтанного мутагенеза в ДНК-геномах значительно ниже (10 -8 - 10 -11 на каждый включенный нуклеотид), чем у РНК-геномных (10 -3 - 10 -4 на каждый включенный нуклеотид). Более высокая частота спонтанных мутаций связана с низкой точностью репликации РНК-геномов, которая вероятно связана с отсутствием у РНК-репликаз корректирующей активности, свойственной ферментам, реплицирующим ДНК. Наиболее часто спонтанные мутации наблюдаются у ретровирусов, что связано с более высокой частотой сбоев в обратной транскрипции, не способных к самокоррекции.
Таким образом, в то время как геномы ДНК-содержащих вирусов относительно стабильны, этого нельзя сказать об РНК-содержащих вирусах, К сожалению для генетиков, ряд факторов стимулирует неравновесие в популяции геномов, и эти факторы часто способствуют накоплению мутантов в популяции. Из-за спонтанного мутагенеза трудно поддерживать гомогенность популяции вируса. Для того чтобы обойти эту трудность, вирусы периодически реклонируют, однако мутанты часто возникают и в ходе образования бляшки, и в ходе роста вируса, поэтому бывает трудно получить генетически однородные препараты вируса с высоким титром.
Индуцированные мутации у вирусов получают при действии различных химических и физических мутагенов, которые подразделяют на действующие in vivo и in vitro .
Большая часть мутантов, выделенных в ходе исследования вирусов животных, получена из популяций дикого типа, обработанных мутагенами. Мутагены обычно применяют для того, чтобы увеличить частоту мутаций в популяции, после чего мутанты подвергают скринингу с помощью подходящего селективного давления. Основной проблемой, связанной с использованием мутагенов, является подбор подходящей дозы. Как правило, желательно получить мутанты, которые отличаются от дикого типа только одной мутацией. Для этого отбор ведут при наиболее низкой дозе мутагена, дающей достаточную частоту мутаций с желаемым фенотипом.
В системах с вирусами животных было использовано множество различных мутагенов, но все они входят в небольшое число классов, определяемых по механизму мутагенеза.
Мутагены одного класса, обычно называемые мутагенами in vitro, действуют путем химической модификации нуклеиновой кислоты, содержащейся в вирусной частице. Азотистая кислота дезаминирует основания, в первую очередь аденин, с образованием гипоксантина, который при последующей репликации спаривается с цитозином. В результате действия азотистой кислоты на аденин происходит транзиция от АТ-пары к GС-паре. Азотистая кислота дезаминирует также цитозин, приводя к транзиции CG->-ТА. Другим мутагеном in vitro является гидроксиламин; он реагирует специфически только с цитозином и вызывает транзицию СG->-ТА. Большой класс мутагенов in vitro представлен алкилирующими агентами, которые действуют на многие позиции в основаниях. Алкилирующие агенты - нитрозогуанидин, этанметансульфонат и ме-тилметансульфонат -являются мощными мутагенами.
Во второй класс входят мутагены in vivo, которые требуют для своего действия метаболически активной нуклеиновой кислоты.
Одна группа мутагенов in vivo содержит аналоги оснований, которые включаются в нуклеиновую кислоту в ходе синтеза по правилам нормального спаривания. Включившись, эти аналоги способны претерпевать таутомерные переходы, которые приводят их к спариванию с различными основаниями, вызывая таким образом транзиции и трансверсии. Часто используют аналоги: 2-аминопу-рин, 5-бромдезоксиуридин и 5-азацитидин.
В другую группу мутагенов in vivo включены интеркалирующие агенты, которые внедряются в стопку оснований, что при последующей репликации нуклеиновой кислоты приводит к вставкам или делециям.
Примерами интеркалирующих агентов являются акридиновые красители, такие как профлавин.
Ультрафиолет также иногда используют в качестве мутагена. Основным продуктом действия ультрафиолета являются димеры пиримидинов. В ДНК пиримидиновые димеры вырезаются. Для РНК механизм ультрафиолетового мутагенеза неизвестен.
Большинству мутаций присуще свойство возврата (реверсии) к дикому типу. Каждая мутация имеет характерную частоту реверсий, которую можно точно измерить.
Классификация вирусных мутаций .
Вирусные мутации классифицируют по изменениям фенотипа и генотипа. По фенотипическим проявлениям мутации вирусов разделяют на четыре группы:
· Мутации, не имеющие фенотипического проявления.
· Летальные мутации, т.е. полностью нарушающие синтез или функцию жизненно важных белков и приводящие к утрате способности к репродукции. Мутация является летальной, если вследствие ее нарушается, например, синтез или функция жизненно важного вирусспецифического белка, например вирусной полимеразы.
· Условно летальные мутации, т.е. мутации с потерей способности синтезировать определенный белок или с нарушением его функции только в определенных условиях. В некоторых случаях мутации являются условно летальными, так как вирусспецифический белок сохраняет свои функции в определенных, оптимальных для него, условиях и теряет эту способность в неразрешающих (непермиссивных) условиях. Типичным примером таких мутаций являются температурно-чувствительные (temperature sensitive) – ts-мутации, при которых вирус теряет способность размножения при повышенных температурах (39-42° С), сохраняя эту способность при обычных температурах выращивания (36-37° С).
· Мутации, имеющие фенотипическое проявление, например изменение размеров бляшек под агаровым покрытием или термостабильности, по изменению спектра хозяев, устойчивости к ингибиторам и химиопрепаратам.
При хромосомных мутациях происходят крупные перестройки структуры отдельных хромосом. В этом случае наблюдаются потеря (делеция) или удвоение части (дупликация) генетического материала одной или нескольких хромосом, изменение ориентации сегментов хромосом в отдельных хромосомах (инверсия), а также перенос части генетического материала с одной хромосомы на другую (транслокация) (крайний случай - объединение целых хромосом, т. н. Робертсоновская транслокация, которая является переходным вариантом от хромосомной мутации к геномной).
Числовые мутации кариотипа подразделяются на гетероплоидию, анеуплоидию, полиплоидию.
Гетероплоидия обозначает общее изменение числа хромосом по отношению к диплоидному полному набору.
Об анеуплоидии говорят в тех случаях, когда число хромосом в клетке увеличено на одну (трисомия) или более (полисомия) или уменьшено на одну (моносомия). Употребляют также термины «гиперплоидия» и «гипоплоидия». Первый из них означает увеличенное число хромосом в клетке, а второй – уменьшенное.
Полиплоидией называют увеличение числа полных хромосомных наборов в четное или нечетное число раз. Полиплоидные клетки могут быть триплоидными, тетраплоидными, пентаплоидными, гексаплоидными и т.д.
29. Спонтанные и индуцированные мутации. Мутагены. Мутагенез и канцерогенез. Генетическая опасность загрязнения окружающей среды. Меры защиты.
Спонтанные мутации.
Мутации, помимо качественных свойств, характеризует и способ
возникновения. Спонтанные (случайные) – мутации, возникающие при нормальных
условиях жизни. Спонтанный процесс зависит от внешних и внутренних факторов
(биологические, химические, физические). Спонтанные мутации возникают у
человека в соматических и генеративных тканях. Метод определения спонтанных
мутаций основан на том, что у детей появляется доминантный признак, хотя у
его родителей он отсутствует. Проведенное в Дании исследование показали,
что примерно одна из 24000 гамет несет в себе доминантную мутацию. Ученый
же Холдейн рассчитал среднюю вероятность появления спонтанных мутаций,
которая оказалась равна 5*10-5 за поколение. Другой ученый Курт Браун
предложил прямой метод оценки таких мутаций, а именно: число мутаций
разделить на удвоенное количество обследованных индивидов.
Индуцированные мутации.
Индуцированный мутагенез – это искусственное получение мутаций с
помощью мутагенов различной природы. Впервые способность ионизирующих
излучений вызывать мутации была обнаружена Г.А. Надсоном и Г.С. Филлиповым.
Затем, проводя обширные исследования, была установлена радиобиологическая
зависимость мутаций. В 1927 году американским ученым Джозефом Мюллером было
доказано, что частота мутаций увеличивается с увеличением дозы воздействия.
В конце сороковых годов открыли существование мощных химических мутагенов,
которые вызывали серьезные повреждения ДНК человека для целого ряда
вирусов. Одним из примеров воздействия мутагенов на человека может служить
эндомитоз – удвоение хромосом с последующим делением центромер, но без
расхождения хромосом.
Мутагены - химические и физические факторы, вызывающие наследственные изменения - мутации. Впервые искусственные мутации получены в 1925 году Г. А. Надсеном и Г. С. Филипповым у дрожжей действием радиоактивного излучения радия; в 1927 году Г. Мёллер получил мутации у дрозофилы действием рентгеновских лучей. Способность химических веществ вызывать мутации (действием иода на дрозофилы) открыта И. А. Рапопортом. У особей мух, развившихся из этих личинок, частота мутаций оказалась в несколько раз выше, чем у контрольных насекомых.
Мутагенами могут быть различные факторы, вызывающие изменения в структуре генов, структуре и количестве хромосом. По происхождению мутагены классифицируют на эндогенные, образующиеся в процессе жизнедеятельности организма и экзогенные - все прочие факторы, в том числе и условия окружающей среды.
По природе возникновения мутагены классифицируют на физические, химические и биологические:
Физические мутагены.
Ионизирующее излучение;
Радиоактивный распад;
Ультрафиолетовое излучение;
Моделированное радиоизлучение и электромагнитные поля;
Чрезмерно высокая или низкая температура.
Химические мутагены.
Окислители и восстановители (нитраты, нитриты, активные формы кислорода);
Алкилирующие агенты (например, иодацетамид);
Пестициды (например гербициды, фунгициды);
Некоторые пищевые добавки (например, ароматические углеводороды, цикламаты);
Продукты переработки нефти;
Органические растворители;
Лекарственные препараты (например, цитостатики, препараты ртути, иммунодепрессанты).
К химическим мутагенам условно можно отнести и ряд вирусов (мутагенным фактором вирусов являются их нуклеиновые кислоты - ДНК или РНК).
Биологические мутагены.
Специфические последовательности ДНК - транспозоны;
Некоторые вирусы (вирус кори, краснухи, гриппа);
Продукты обмена веществ (продукты окисления липидов);
Антигены некоторых микроорганизмов.
Канцерогенез- сложный патофизиологический процесс зарождения и развития опухоли. Изучение процесса канцерогенеза является ключевым моментом как для понимания природы опухолей, так и для поиска новых и эффективных методов лечения онкологических заболеваний. Канцерогенез - сложный многоэтапный процесс, ведущий к глубокой опухолевой реорганизации нормальных клеток организма. Из всех предложенных до ныне теорий канцерогенеза, мутационная теория заслуживает наибольшего внимания. Согласно этой теории, опухоли являются генетическими заболеваниями, патогенетическим субстратом которых является повреждение генетического материала клетки (точечные мутации, хромосомные аберрации и т. п.). Повреждение специфических участков ДНК приводит к нарушению механизмов контроля за пролиферацией и дифференцировкой клеток и в конце концов к возникновению опухоли. Генетический аппарат клеток обладает сложной системой контроля деления, роста и дифференцировки клеток. Изучены две регулирующие системы оказывающие кардинальное влияние на процесс клеточной пролиферации. Протоонкогены- это группа нормальных генов клетки, оказывающих стимулирующее влияние на процессы клеточного деления, посредством специфических продуктов их экспрессии. Превращение протоонкогена в онкоген (ген, определяющий опухолевые свойства клеток) является одним из механизмов возникновения опухолевых клеток. Это может произойти в результате мутации протоонкогена с изменением структуры специфического продукта экспрессии гена, либо же повышением уровня экспрессии протоонкогена при мутации его регулирующей последовательности (точечная мутация) или при переносе гена в активно транскрибируемую область хромосомы (хромосомные аберрации). На данный момент изучена канцерогенная активность протоонкогенов группы ras (HRAS, KRAS2). При различных онкологических заболеваниях регистрируется значительное повышение активности этих генов (рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря и т. д.). Также раскрыт патогенез лимфомы Беркитта, при которой активация протоонкогена MYC происходит в случае его переноса в область хромосом, где содержатся активно транскрибируемые гены иммуноглобулинов.
Функции генов-супрессоров противоположны функциям протоонкогенов. Гены-супрессоры оказывают тормозящее влияние на процессы клеточного деления и выхода из дифференцировки. Доказано, что в ряде случаев инактивация генов-супрессоров с исчезновением их антагонистического влияния по отношению к протоонкогенам ведет к развитию некоторых онкологических заболеваний. Так, потеря участка хромосомы, содержащего гены-супрессоры, ведет к развитию таких заболеваний, как ретинобластома, опухоль Вильмса и др.
Таким образом, система протоонкогенов и генов-супрессоров формирует сложный механизм контроля темпов клеточного деления, роста и дифференцировки. Нарушения этого механизма возможны как под влиянием факторов внешней среды, так и в связи с геномной нестабильностью - теория, предложенная Кристофом Лингауром и Бертом Фогельштейном. Питер Дюсберг из Калифорнийского университета в Беркли утверждает, что причиной опухолевой трансформации клетки может быть анеуплоидия (изменение числа хромосом или потеря их участков), являющаяся фактором повышенной нестабильности генома. По мнению некоторых ученых, ещё одной причиной возникновения опухолей мог бы быть врождённый или приобретённый дефект систем репарации клеточной ДНК. В здоровых клетках процесс репликации (удвоения) ДНК протекает с большой точностью благодаря функционированию специальной системы исправления пострепликационных ошибок. В геноме человека изучено, по крайней мере, 6 генов, участвующих в репарации ДНК. Повреждение этих генов влечёт за собой нарушение функции всей системы репарации, и, следовательно, значительное увеличение уровня пострепликационных ошибок, то есть мутаций.
Мутационная теория канцерогенеза - учение, согласно которому причиной возникновения злокачественных опухолей являются мутационные изменения генома клетки. В настоящее время эта теория является общепринятой. В подавляющем большинстве случаев злокачественные новообразования развиваются из одной опухолевой клетки, то есть имеют моноклональное происхождение. Согласно современным представлениям, мутации, которые в конце концов приводят к развитию опухоли, могут иметь место как в половых (около 5 % всех случаев), так и в соматических клетках.
Успехи современной генетики позволяют подойти к изучению состояния окружающей среды с позиций охраны наследственности, генофонда биосферы. Такому подходу уделяется специальное внимание в Программе ООН по окружающей среде (ЮНЕП), в деятельности Всемирной организации здравоохранения <ВОЗ) и ЮНЕСКО (в программе МАБ «Человек и биосфера», проект 12). По инициативе советских ученых было начато создание центра по генетическому мониторингу, в задачу которого входит и разработка доступных методов для оценки степени воздействия загрязнения окружающей среды на экосистемы и здоровье человека.
Между тем изменения в биосфере, преобразуемой человеком, порождают влияющие на ход генетических процессов неконтролируемые факторы. В числе их и мутационные эффекты, вызываемые загрязнением окружающей среды, приобретающим ныне все большие масштабы.
Основная опасность загрязнения окружающей среды мутагенами, как полагают генетики, заключается в том, что вновь возникающие мутации, не «переработанные» эволюционно, отрицательно повлияют на жизнеспособность любых организмов. И если поражение зародышевых клеток может привести к росту числа носителей мутантных генов и хромосом, то при повреждении генов соматических клеток возможно возрастание числа раковых заболеваний. Более того, существует глубокая связь различных на первый взгляд биологических эффектов.
В частности, мутагены окружающей среды влияют на величины рекомбинаций наследственных молекул, являющихся также источником наследственных изменений. Возможно и влияние на функционирование генов, что может быть причиной, например, тератологических отклонений (уродств), наконец, вероятны поражения ферментных систем, что изменяет различные физиологические особенности организма, вплоть до деятельности нервной системы, а следовательно, сказывается и на психике. Генетическая адаптация популяций человека к возрастающему загрязнению биосферы мутагенными факторами принципиально невозможна. Чтобы исключить или ослабить воздействие мутагенов, прежде всего необходимо оценить мутагенность различных загрязнений на высокочувствительных биологических тест-системах, в том числе и тех, которые могут поступить в биосферу, и если риск для человека доказан, то принимать меры для борьбы с ними.
Так возникает задача скрининга - просеивания загрязнений с целью выявления мутагенов и выработки специального законодательства для регулирования их поступления в окружающую среду. И таким образом, контроль генетических последствий загрязнения в комплексе содержит в себе две задачи: испытание на мутагенность факторов среды различной природы (скрининг) и мониторинг популяций. Применяется и цитогенетическая методика тестирования на культуре ткани растений, животных, лимфоцитах человека. Также и тест с использованием метода доминантных леталей (выявление мутаций, которые вызывают гибель эмбрионов на самых ранних стадиях развития) на млекопитающих, в особенности на мьи. ах. Наконец, используется и прямое тестирование мутаций в клетках млекопитающих и человека как в культуре ткани, так и in vivo.
К абиотическим факторам любой экосистемы относятся ионизирующее излучение и загрязняющие вещества. Токсичность и мутагенность среды - это два взаимосвязанных понятия. Одни и те же факторы среды могут оказывать и токсичное, и мутагенное действие. Токсичное действие проявляется вскоре после контакта с фактором, не более чем через месяц. Оно может выражаться в виде аллергии, ослабления иммунной системы, отравления, развития неврозов, возникновения неизвестных ранее патологий.
Гораздо чаще токсичность среды проявляется в виде устойчивых отклонений от нормального физиологического состояния организма у большого количества людей, которые заняты на вредном производстве или живут в прилегающих к предприятию районах.
Загрязняющие вещества чаще всего - это отходы производства и автомобильного транспорта: сернистый ангидрид, оксиды азота и углерода, углеводороды, соединения меди, цинка, ртути, свинца.
Загрязняющими веществами также могут быть химические соединения, созданные человеком, например пестициды, используемые для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур.
Мутагенность окружающей среды никогда не проявляется сразу после контакта с фактором. Опасность мутагенов для человека состоит в том, что их многократное и длительное контактное действие приводит к возникновению мутаций - стойких изменений в генетическом материале. С накоплением мутаций клетка приобретает способность к бесконечному делению и может стать основой развития онкологического заболевания (раковой опухоли).
Возникновение мутаций - процесс длительный и сложный, поскольку в клетках имеется надежная защитная система, которая противостоит мутационному процессу.
Развитие мутации зависит от дозы мутагена и длительности его действия, а также от того, насколько часто мутаген действует на организм, т.е. от ритма его действия. Процесс развития мутаций может быть растянут на годы.
На первом месте среди воздействий, вызывающих глубокие изменения генетического аппарата, стоит радиация. Наглядный пример мутагенного действия окружающей среды - развитие прогрессирующей лучевой болезни, которая заканчивается смертельным исходом у людей, получивших высокую дозу радиации. Такие случаи встречаются редко. Обычно они обусловлены аварийными ситуациями, нарушением технологических процессов.
Радиационный распад, или явление радиоактивности, связан со способностью атомов отдельных химических элементов испускать частицы, несущие энергию. Основной характеристикой излучения, определяющей степень его воздействия на организм, является доза. Доза - это количество переданной организму энергии. Однако, при одинаковой поглощенной дозе, разные типы излучения могут иметь разный биологический эффект.
Под действием радиоактивного излучения в клетках происходит ионизация атомов и молекул, в том числе и молекул воды, что вызывает цепь каталитических реакций, приводящих к функциональным изменениям клеток. Наиболее радиочувствительны клетки постоянно обновляющихся органов и тканей: костного мозга, половых желез, селезенки. Изменения касаются механизмов деления, наследственного материала в составе хроматина и хромосом, регуляции процессов обновления и специализации клеток.
Радиация как мутагенный фактор вызывает повреждение генетического аппарата клеток: молекул ДНК, изменение кариотипа в целом. Мутации в соматических клетках облученного человека приводят к развитию лейкозов или других опухолей разных органов. Мутации в половых клетках проявляются в последующих поколениях: у детей и более отдаленных потомков человека, подвергшегося облучению. Генетические дефекты мало зависят от дозы и кратности облучения. Даже сверхмалые дозы радиации могут стимулировать мутации, иначе говоря, пороговая доза радиации отсутствует.
Опасность радиационного облучения связана с тем, что органы чувств человека не могут улавливать ни один из видов излучения. Установить факт радиоактивного заражения местности можно только приборами.
Радиационную опасность представляют старые захоронения, относящиеся к тому времени, когда радиационным проблемам еще не уделяли должного внимания. Опасные ситуации могут возникать при утилизации отработанного ядерного топлива от АЭС и атомных подводных лодок, при захоронении радиоактивных отходов, которые образовались после уничтожения ядерного оружия. Кроме того, радиоактивные отходы имеют множество промышленных предприятий, научных и медицинских учреждений
Радиация, связанная с развитием ядерной энергетики, составляет лишь малую долю, порождаемую деятельностью человека. Применение рентгеновских лучей в медицине, сжигание угля, длительное пребывание в хорошо герметизированных помещениях могут привести к значительному увеличению уровня облучения.
Избежать облучения ионизирующим излучением невозможно. Жизнь на Земле возникла и продолжает развиваться в условиях постоянного естественного облучения. Помимо техногенных радионуклидов свой вклад в радиационный фон Земли вносят космическое излучение и излучение от рассеянных в земной коре, воздухе и других объектах природных радиоактивных компонентов.
Мутагенными свойствами обладают не только различного типа излучения, но и многие химические соединения: естественные неорганические вещества (окислы азота, нитраты, соединения свинца), переработанные природные соединения (продукты сжигания угля, нефти, древесины, соединения тяжелых металлов), химические продукты, не встречающиеся в природе (пестициды, некоторые пищевые добавки, промышленные отходы, часть синтетических соединений).
Выраженным мутагенным действием в атмосфере городов обладают оксиды азота (III) и (V), которые при взаимодействии с атмосферной влагой образуют азотистую и азотную кислоты, а также выбросы дизельных двигателей; бензопирен, пыль асбеста, диоксины, - образующиеся при неконтролируемом сжигании твердых бытовых и промышленных отходов.
В составе гидросферы наиболее выраженным мутагенным действием обладают соли тяжелых металлов (никель, марганец) и пестициды.
В почве к числу химических мутагенов относятся соли тяжелых металлов и ме-таллорганических соединений, которыми почва загрязнена вдоль автомагистралей и в районах свалок мусора. Например, свинец - один из максимально опасных загрязнителей почв среди металлов. Он может накапливаться в организме человека, вызывая хронические отравления, проявляющиеся в истощении организма, нарушении работы почек, мышечной слабости, тяжелых расстройствах нервной и кровеносной систем. Употребление в пищу растений, грибов и ягод, собранных вблизи автомагистралей, может привести к пищевому отравлению свинцом, а через несколько лет эффект может проявиться в виде мутации.
В отличие от радиоактивного излучения химические мутагены оказывают действие только при непосредственном контакте с клетками организма. Они могут попасть на кожу, слизистые оболочки дыхательных путей, с продуктами питания оказываться в пищеварительной системе, а затем с питательными веществами перейти в кровь.
Мутации, индуцированные радиацией
Именно при исследовании радиационного мутагенеза была впервые показана возможность индуцировать мутации при действии факторов внешней среды.
Основы радиационной генетики были заложены работами Г.А.Надсона и Г.Т.Филиппова в 1925г. в опытах на плесневых и дрожжевых грибах.
Позже, в 1927г. Г.Д.Меллер, используя методы количественного учета мутаций у дрозофилы, обосновал факт мутагенного действия рентгеновских лучей.
В 1928г. Л.Д.Стадлер в опытах на ячмене и кукурузе показал, что ионизирующие излучения разных видов способны вызывать мутации.
В последующие два десятилетия происходило достаточно активное развитие классической радиационной генегики. Основные положения ее изложены в трудах Д.Ли, Д.Кэтчсайда, Н.В.Тимофеева-Ресовского, К.Г.Циммера, А.Хол-ландера, А.С.Серебровского, Н.П.Дубинина, Ядерные взрывы, прогремевшие в Хиросиме и Нагасаки, стимулировали бурное развитие работ по изучению влияния радиации на человека. Усилия ученых многих стран привели к разработке современных представлений о механизмах воздействия ионизирующих излучений. При этом основные закономерности воздействия ионизирующих излучении были вскрыты в исследованиях, проведенных на микроорганизмах, растениях и животных. Используя принципы экстраполяции, результаты, полученные на экспериментальных объектах, широко используют для оценки генетического риска облучения человека. Например, исследования, проведенные на мышах, в ходе которых изучали частоту индуцированных радиацией катаракт и скелетных аномалий, явились основой для расчета ожидаемой частоты индуцированных доминантных мутаций у человека.
Все радиобиологические эффекты, вызываемые ионизирующими излучениями у различных видов живых существ, могут быть подразделены на стохастические и нестохастические.
Стохастические эффекты характеризуются линейной беспороговой зависимостью вероятности их появления от дозы ионизирующего излучения. При этом от величины дозы зависит частота рассматриваемых событий, а не их тяжесть. К таким эффектам относятся генетические последствия облучения и радиационный канцерогенез.
Нестохастические эффекты имеют пороговую (сигмоидную) зависимость от дозы, причем с дозой связана как вероятность эффекта, так и его тяжесть. Примерами нестохастических эффектов являются: лучевая болезнь, сокращение продолжительности жизни, смертность, индуцированные радиацией пороки развития, поражение иммунной системы. Следует заметить, что механизмы возникновения стохастических и нестохастических эффектов совершенно различны, поэтому при оценке рисков появления этих эффектов в результате облучения недопустимо их объединение.
Сходство и различие спонтанных и индуцированных мутаций
В повреждающем действии радиации на генетический аппарат клетки есть несколько основных моментов, которые имеют важное значение для оценки последствий облучения.
Как показали многочисленные исследования, ионизирующие излучения вызывают все типы мутаций, свойственные спонтанному, мутационному процессу - точковые мутации, аберрации хромосом и генные мутации. Однако следует отметить, что не все типы спонтанных мутаций с одинаковой частотой увеличиваются под действием радиации.
Одним из фундаментальных предложений, на которых основаны оценки риска облучения человека, является допущение сходства спонтанных и индуцированных ионизирующими излучениями мутаций. Предполагая такое сходство, можно оценить вред, причиненный воздействием радиации, путем расчета, какую прибавку к спонтанному мутационному процессу дает мутагенез, вызванный облучением. Так производится определение дозы, удваивающей естественный мутационный процесс. Однако экспериментальные данные молекулярной генетики демонстрируют различия между спонтанными и индуцированными мутациями, вызывающими менделевские болезни. Остановимся на этом важном вопросе и рассмотрим различия между этими мутациями:
спонтанные мутации - это чаще всего точковые мутации и небольшие делеции;
индуцированные мутации - делеции, затрагивающие многие гены.
Спонтанные мутации могут вызывать как утрату, так и усиление функции генов, большинство же индуцированных мутаций вызывает потерю функции. Происхождение спонтанных мутаций связано с организацией генов, т.е. они сайт-специфичны.
Ииндуцированные мутации происходят в результате случайного попадания энергии излучения в генетический материал и могут затрагивать несколько генов, имеющих разное значение для выживаемости организма.
Из этих различий между спонтанными и индуцированными мутациями следует важное следствие: вероятность того, что радиация приведет к возникновению мутаций, обладающих такой же специфичностью, какой обладают спонтанные мутации, очень мала. Другими словами, спектры спонтанных и индуцированных радиацией мутаций, как следует из молекулярно-генетических исследований, существенно различаются.
Ионизирующие излучения в основном индуцируют микроделеции, поэтому важно проанализировать, какими проявлениями на уровне фенотипа человека сопровождаются такие микроделеционные изменения. Поскольку данные о микроделеционных синдромах, связанных с воздействием ионизирующих излучений на человека, отсутствуют, рассмотрим, к каким последствиям для здоровья человека приводят спонтанные синдромы, связанные с микроделециями. Таких синдромов в настоящее время известно около 30. Все они связаны с микроделециями в разных хромосомах и обычно сопровождаются потерей функции нескольких генов. Фенотипы носителей таких микроделеции зависят от участков хромосом, затронутых микроделециями (например, хромосомы 19 и 22 изобилуют генами, а хромосомы 4 и 13 генами обеднены), но тем не менее разные делеции имеют ряд общих признаков - они вызывают многочисленные нарушения развития, умственную отсталость, замедленный рост, дисморфные черты лица. Очевидно, такие же изменения в фенотипе человека будут вызывать микроделеции, возникающие в результате радиационного воздействия. Основной особенностью таких микроделеционных фенотипов является несходное с фенотипами большинства спонтанных мутаций, нечеткое, неясное их проявление.
Различия в клинических фенотипах спонтанных и индуцированных ионизирующими излучениями мутаций имеют принципиальное значение для оценки риска облучения человека. Дело в том, что при изучении последствий воздействия ионизирующих излучений на популяции человека обычно проводят анализ социально значимых отклонений от нормы, которое традиционно связывают с отклонениями, подобными фенотипическим проявлениям спонтанных мутаций. Изменения же, связанные с микроделеционными синдромами, практически остаются вне поля зрения исследователей в силу их нечеткого проявления. Таким образом, большая часть фенотипических отклонений, связанных с микроделециями, индуцированными ионизирующими излучениями, практически составляют не учтенный пока компонент генетического риска облучения популяций человека.
Индуцированный мутагенез – это искусственное получение мутаций с помощью мутагенов различной природы. Впервые способность ионизирующих излучений вызывать мутации была обнаружена Г.А. Надсоном и Г.С. Филлиповым. Затем, проводя обширные исследования, была установлена радиобиологическая зависимость мутаций. В 1927 году американским ученым Джозефом Мюллером было доказано, что частота мутаций увеличивается с увеличением дозы воздействия. В конце сороковых годов открыли существование мощных химических мутагенов, которые вызывали серьезные повреждения ДНК человека для целого ряда вирусов.
Одним из примеров воздействия мутагенов на человека может служить эндомитоз –удвоение хромосом с последующим делением центромер, но без расхождения хромосом.
Роль генотипа и внешней среды в проявлении признаков.
Первоначально развитие генетики сопровождалось представлением о фатальности влияния наследственности на структуру, функцию и психологические признаки человека.
Однако уже с конца XIX века многие исследователи отмечали, что свойства любого организма могут меняться под воздействием условий внешней среды. Еще в 1934 г. профессор С.Н. Давиденков опубликовал работу "Проблемы полиморфизма наследственных болезней нервной системы", в которой он подчеркивал, что вариабельность течения этих заболеваний может быть вызвана влиянием как других генов, так и внешней среды. Даже синтез одного белка является сложным и многоэтапным процессом, который регулируется на всех стадиях (транскрипции, процессинга, транспорта РНК из ядра, трансляции, формирования вторичной, третичной и четвертичной структур). Кроме того, время, количество, скорость и место его образования определяются множеством различных генетических и средовых факторов. Целостный организм, включающий большое количество разнообразных белков, функционирует как единая система, в которой развитие одних структур зависит от функции других и необходимости приспособления к меняющимся условиям внешней среды.
Так, например, патологические изменения гена контролирующего фермент фенилаланингидроксилазу, приводят к нарушению обмена аминокислоты фейилаланина. В результате поступающий с белком пищевых продуктов фенилаланин накапливается в организме человека, являющегося гомозиготой по аномальному гену, что вызывает поражение нервной системы. Но специальная диета, ограничивающая поступление с пищей этой аминокислоты, обеспечивает ребенку нормальное развитие. Таким образом, фактор внешней среды (в данном случае диета) меняет фенотипическое действие гена, в которых существует организм человека, могут модифицировать детерминированные признаки. Например, рост ребенка контролируется целым рядом пар нормальных генов, регулирующих обмен гормонов, минералов, пищеварение и т.д. Но даже если изначально генетически определен высокий рост, а человек живет в плохих условиях (недостаток солнца, воздуха, неполноценное питание), то это приводит к низкорослости. Уровень интеллекта будет выше у человека, получившего хорошее образование, нежели у ребенка, который воспитывался в плохих социальных условиях и не мог учиться.
Таким образом, развитие любого организма зависит и от генотипа, и от факторов внешней среды. Это означает, что аналогичный у двух особей генотип не обеспечивает однозначно одинаковый фенотип, если эти индивиды развиваются в разных условиях.
Только генотип или только факторы внешней среды не могут определить формирование фенотипическнх характеристик какого-либо признака. Так, например, нельзя определить уровень интеллекта человека, не контактировавшего с факторами внешней среды - таких людей нет.
Важной задачей генетики является уточнение роли наследственных и внешнесредовых факторов в формировании того или иного признака. Фактически необходимо оценить степень обусловленности количественных характеристик организма генетической изменчивостью (т.е. генетическими различиями между особями) или средовой изменчивостью (т.е. различиями внешних факторов). Для количественной оценки этих воздействий американский генетик Дж. Лаш ввел термин "наследуемость".
Наследуемость отражает вклад генетических факторов в фенотипическое проявление конкретного признака. Этот показатель может иметь значение в интервале от 0 до 1 (0-100%). Чем ниже уровень наследуемости, тем меньше роль генотипа в изменчивости данного признака. Если наследуемость приближается к 100%, то фенотипическая изменчивость признака почти полностью определяется наследственными факторами.
До сих пор речь шла о спонтанных мутациях, т.е. происходящих без какой-либо известной причины. Возникновение мутаций – процесс вероятностный, и, соответственно, существует набор факторов, которые на эти вероятности влияют и изменяют их. Факторы, вызывающие мутации, называются мутагенами, а процесс изменения вероятностей появления мутации – индуцированном. Мутации, возникающие под влиянием мутагенов, называют индуцированными мутациями.
В современном технологически сложном обществе люди подвергаются воздействию самых разных мутагенов, поэтому изучение индуцированных мутаций приобретает все большее значение.
К физическим мутагенам относятся все виды ионизирующих излучений (гамма- и рентгеновские лучи, протоны, нейтроны и др.), ультрафиолетовое излучение, высокие и низкие температуры; к химическим – многие алкилирующие соединения, аналоги азотистых оснований нуклеиновых кислот, некоторые биополимеры (например, чужеродные ДНК и РНК), алкалоиды и многие другие химические агенты. Некоторые мутагены увеличивают частоту мутаций в сотни раз.
К числу наиболее изученных мутагенов относятся радиация высоких энергий и некоторые химические вещества. Радиация вызывает такие изменения в геноме человека, как хромосомные аберрации и потерю нуклеотидных оснований. Частота встречаемости мутаций половых клеток, индуцированных радиацией, зависит от пола и стадии развития половых клеток. Незрелые половые клетки мутируют чаще, чем зрелые; женские половые клетки – реже, чем мужские. Кроме того, частота мутаций, индуцированных радиацией, зависит от условий и дозы облучения.
Соматические мутации, возникающие в результате радиации, представляют собой основную угрозу населению, поскольку часто появле ние таких мутаций служит первым шагом на пути образования раковых опухолей. Так, одно из наиболее драматических последствий Чернобыльской аварии связано с возрастанием частоты встречаемости разных типов онкологических заболеваний. Например, в Гомельской области было обнаружено резкое увеличение числа детей, больных раком щитовидной железы. По некоторым данным, частота этого заболевания сегодня по сравнению с доаварийной ситуацией увеличилась в 20 раз.
В начале 50-х годов ХХ века была обнаружена возможность замедления или ослабления темпов мутирования с помощью некоторых веществ. Такие вещества назвали антимутагенами. Выделено около 200 природных и синтетических соединений, обладающих антимутагенной активностью: некоторые аминокислоты (аргинин, гистидин, метианин), витамины (токоферол, аскорбиновая кислота, ретинол, каротин), ферменты (пероксидаза, НАДФ-оксидаза, каталаза и др.), комплексные соединения растительного и животного происхождения, фармокологические средства (интерферон, оксипиридины, соли селена и др.).
Подсчитано, что с пищей человек получает в день несколько граммов веществ, способных вызвать генетические нарушения. Такие количества мутагенов должны вызывать существенные поражения в наследственных структурах человека. Но этого не происходит, т. к. антимутагены пищи нейтрализуют эффекты мутагенов. Соотношение антимутагенов и мутагенов в продуктах зависит от способа приготовления, консервирования и сроков хранения. Антимутагенами бывают не только компоненты, но и пищевые продукты в целом: экстракты различных видов капусты уменьшают уровень мутаций в 8 – 10 раз, экстракт яблок – в 8 раз, винограда – в 4 раза, баклажана – в 7, зелёного перца – в 10, а мятного листа – в 11 раз. Среди лекарственных трав отмечено антимутагенное действие зверобоя.
Вопросы для обсуждения:
1. Участок гена, кодирующий полипептид, имеет в норме следующий порядок основания: ААГСААСААТТАГТААТГААГЦААЦЦЦ. Какие изменения произойдут в белке, если во время репликации в шестом кодоне появилась вставка тимина между вторым и третьим нуклеотидами?
2. На участке гена, кодирующего полипептид последовательность нуклеотидных оснований следующая: ГААЦГАТТЦГГЦЦАГ. Произошла инверсия на участке второго – седьмого нуклеотида. Определите структуру полипептидной цепи в норме и после мутации.
3. Расшифруйте послание:
ДОЖТВЧНАЧНАШКОДТАКМАЛКОНГНЪ
ДПЩНАЧТАКЛИХНАШКОДКОНЖЦФРДХ
НАЧБЫЛДЫМБЫЛПАЛКОНХНСКУВЗЩГ
ВДЪХЗГЧВФНАЧНЕТЖИВНАШРОДПВЧ
Какие принципы генетического кода здесь использованы?
4. Определите возможные генотипы детей в браке здоровой женщины и мужчины с синдромом Клайнфельтера?
5. Какие из следующих заболеваний не связаны с нарушением мейотического расхождения хромосом: а. Синдром Тернера; б. Синдром Дауна; в синдром кошачьего крика; г. синдром Патау.