Проведение исследований методом ПЦР допускается на базе действующих лабораторий при условии организации в лаборатории самостоятельных или выделенных в составе других функциональных помещений рабочих зон, соответствующих этапам ПЦР-анализа.
ПЦР-лаборатория должна включать следующий минимальный набор рабочих зон:
- приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала;
- выделения ДНК/РНК;
- приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР;
- детекции продуктов амплификации методом электрофореза или ГиФА.
Важно отметить, что в случае применения метода нет необходимости в детекции продуктов амплификации методом электрофореза. Следовательно, рабочую зону в помещении лаборатории для электрофореза можно не выделять.
В ПЦР-лабораториях необходимо также предусмотреть наличие вспомогательных помещений: архив (для учетных документов), комнату для персонала, кабинет заведующего, раздевалки для сотрудников, комнаты приема пищи, санитарных комнат (туалет), подсобных помещений (склад).
В идеальном варианте необходимо иметь автоклавную комнату для обеззараживающего исследуемого материала. Она может быть общей с другими подразделениями учреждения при условии соблюдения требований биологической безопасности.
Помещения для выполнения работ на этапах ПЦР-анализа должны быть боксированными (боксы с предбоксами). В зоне приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала проводят прием материала, пробоподготовку (сортировку, маркировку, центрифугирование и прочее), хранение и первичную инактивацию остатков биоматериала дезинфицирующими средствами. Зону приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала располагают в комнате приема материала или в отдельном боксированном помещении. Здесь же можно проводить прием и обработку проб для исследования другими методами (иммунология, например), при условии выделения отдельного оборудованного рабочего места для ПЦР-анализа.
Зону выделения ДНК/РНК размещают в отдельном помещении. При организации ПЦР-лаборатории на базе действующей лаборатории допускается выделение ДНК/РНК в помещениях, в которых проводят другие виды исследований, кроме генно-инженерных работ. В этом случае в помещении организуют рабочую зону для выделения ДНК/РНК, в которой располагают ПЦР-бокс или бокс биологической безопасности. В ПЦР-боксе для выделения ДНК/РНК не допускается проведение других видов работ!
В зоне приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР производят приготовление ПЦР-смеси, внесение в пробирку для ПЦР выделенных препаратов ДНК/РНК или кДНК, обратную транскрипцию РНК и амплификацию ДНК или кДНК. Помещение для приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР должно быть отдельным. Приготовление реакционных ПЦР-смесей проводят в ПЦР-боксе.
При необходимости этап выделения ДНК/РНК может быть совмещен в одном помещении с этапом приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР при наличии в нем отдельных ПЦР-боксов - для подготовки реакционных ПЦР-смесей и для выделения ДНК/РНК.
Зону детекции продуктов амплификации располагают в отдельном помещении, по возможности оснащенном ПЦР-боксом. При необходимости одновременного использования для детекции продуктов амплификации метода электрофореза и метода гибридизационного анализа следует выделить в помещении детекции отдельную рабочую зону для проведения гибридизационного анализа. В этом случае оборудование и принадлежности для каждого вида детекции маркируют применительно к каждой зоне. Не допускается использовать для проведения гибридизационного анализа пипетки и посуду, предназначенные для электрофореза.
Планировочные решения и размещение оборудования должны обеспечивать поточность движения исследуемого материала. Следует полностью исключить воздухообмен между помещением детекции продуктов амплификации и другими помещениями.
ПЦР-лабораторию оборудуют водопроводом, канализацией, электричеством и отоплением. Все помещения ПЦР-лаборатории обеспечивают достаточным естественным и искусственным освещением.
При строительстве новых или реконструкции имеющихся ПЦР-лабораторий помещения оборудуют приточно-вытяжной или вытяжной вентиляцией. Разница в давлении воздуха в помещениях ПЦР-лаборатории достигается за счет различий в кратности воздухообмена в них. Кратность воздухообмена должна соответствовать значениям, приведенным в таблице:
При необходимости в ПЦР-лаборатории могут быть установлены кондиционеры.
Внутреннюю отделку помещений выполняют в соответствии с их функциональным назначением. Поверхности стен, пола и потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми, устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы не должны быть скользкими. Лабораторная мебель должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств. Поверхность столов не должна иметь трещин и швов. Помещения лаборатории должны быть непроницаемы для грызунов и насекомых. ПЦР-лабораторию обеспечивают средствами пожаротушения.
УРОГЕНИТАЛЬНЫЙ ХЛАМИДИОЗ
Материал для исследования Соскоб из уретры или цервикального канала, секрет предстательной железы, осадок мочи. У новорожденных в качестве материала для исследования используют соскоб с конъюктивы глаз и задней стенки глотки. У девочек в качестве материала для исследования используют соскоб из вульвы, у мальчиков - мочу.
Подготовка пациента, взятие биологического материала и условия его транспортировки За 10 дней до взятия материала на исследование необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры.
Особенности взятия материала из уретры
- перед взятием материала пациенту рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 1,5-2 часов;
- непосредственно перед взятием материала наружное отверстие уретры необходимо обработать тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором;
- при наличии гнойных выделений соскоб рекомендуется брать через 15-20 мин после мочеиспускания, при отсутствии выделений необходимо провести массаж уретры с помощью зонда для взятия материала;
- у женщин перед введением зонда в уретру проводится ее массаж о лобковое сочленение;
- в уретру у женщин зонд вводится на глубину 1,0-1,5 см, у мужчин - на 3-4 см и затем делается несколько вращательных движений; у детей материал для исследования берут только с наружного отверстия уретры;
Особенности взятия материала из цервикального канала
- перед взятием материала необходимо удалить ватным тампоном слизь и затем обработать шейку матки стерильным физиологическим раствором;
- зонд вводится в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см;
- при наличии эрозий цервикального канала необходимо их обработать стерильным физиологическим раствором, и материал следует брать на границе здоровой и измененной ткани;
- при извлечении зонда необходимо полностью исключить его касание со стенками влагалища;
После взятия материала зонд опускается в пробирку с транспортной средой “ДНК-ЭКСПРЕСС”. После внесения зонда в транспортную среду он несколоко раз ротируется, а затем удаляется из пробирки. Про-бирка закрывается и маркируется. Если время транспортировки биологического материала с момента взя-тия до момента его доставки в лабораторию более 2-х часов, то пробирку необходимо заморозить при -20 0 С. Транспортировка биологического материала должна производиться только в сумке-холодильнике. В замороженном виде биологический материал может храниться не более 2-х недель.
Особенности взятия секрета предстательной железы
Перед взятием секрета простаты головка полового члена обрабатывается стерильным ватным тампоном, смоченным физиологическим раствором. Секрет простаты берется после предварительного массажа простаты через прямую кишку. Врач проводит массаж с надавливанием несколькими энергичными движениями от основания к верхушке. Затем из кавернозной части выдавливается простатитческий секрет. Транспортировка биологического материала должна производиться только в сумке-холодильнике.
Особенности взятия (сбора) мочи
Мочу собирают утром натощак после сна или не ранее чем через 2-3 часа после последнего мочеиспускания. Утренняя моча отстаивается в течение 1 часа, затем осторожно сливается, оставляя только придонную часть - около 10 мл. Этот остаток сливают в центрифужную пробирку и центрифугируют. Затем надосадочную жидкость вновь сливают, а осадок (без жидкости) зондом переносят в пробирку для ПЦР.
До получения осадка мочу нельзя охлаждать или замораживать.
Особенности взятия материала с задней стенки глотки
Одноразовый зонд вводят за мягкое небо в носоглотку и проводят по задней стенке глотки. После взятия материала зонд опускается в пробирку с транспортной средой “ДНК-ЭКСПРЕСС”. После внесения зонда в транспортную среду он несколоко раз ротируется, а затем удаляется из пробирки. Пробирка закрывается и маркируется. Если время транспортировки биологического материала с момента взятия до момента его доставки в лабораторию более 2-х часов, то пробирку необходимо заморозить при -200С. Транспортировка биологического материала должна производиться только в сумке-холодильнике. В замороженном виде биологический материал может храниться не более 2-х недель.
Особенности взятия материала с конъюктивы глаз
При наличии обильного гнойного отделяемого его убирают стерильным ватным тампоном, смоченным физиологическим раствором. Соскоб берут с внутренней поверхности нижнего века движением к внутреннему углу глазной щели. При взятии соскоба необходимо придерживать веко руками, чтобы при моргании ресницы не касались зонда.
После взятия материала зонд опускается в пробирку с транспортной средой “ДНК-ЭКСПРЕСС”. После внесения зонда в транспортную среду он несколоко раз ротируется, а затем удаляется из пробирки. Пробирка плотно закрывается. Если время транспортировки биологического материала с момента взятия до момента его доставки в лабораторию более 2-х часов, то пробирку необходимо заморозить при -200С. Транспортировка биологического материала должна производиться только в сумке-холодильнике. В замороженном виде биологический материал может храниться не более 2-х недель.
УРОГЕНИТАЛЬНЫЙ МИКОПЛАЗМОЗ
Материал для исследования Отделяемое уретры, влагалища, цервикального канала, моча (центрифугат утренней первой и средней порций), секрет простаты, сперма.
Особенности взятия материала из влагалища
Материал должен быть взят до проведения мануального исследования. Зеркало перед манипуляцией можно смочить горячей водой, применение антисептиков для обработки зеркала противопоказано. Влагалищное отделяемое собирают стерильным одноразовым зондом из заднего нижнего свода или с патологически измененных участков слизистой и помещают в пробирку с транспортной средой “ДНК-ЭКСТПЕСС”. У девочек взятие материала производят со слизистой оболочки преддверия влагалища, а в отдельных случаях - из заднего свода влагалища через гименальные кольца. После внесения зонда в транспортную среду он несколоко раз ротируется, а затем удаляется из пробирки. Пробирка закрывается и маркируется. Если время транспортировки биологического материала с момента взятия до момента его доставки в лабораторию более 2-х часов, то пробирку необходимо заморозить при -200С. Транспортировка биологического материала должна производиться только в сумке-холодильнике. В замороженном виде биологический материал может храниться не более 2-х недель.
ГОНОРЕЯ
Материал для исследования Отделяемое уретры, цервикального канала, секрет предстательной железы, осадок мочи.
Подготовка пациента, взятие биологического материала и условия его транспортировки См. урогенитальный хламидиоз.
За 10 дней до взятия материала на исследование необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. Материал для исследования у женщин следует брать перед менструацией или через 1-2 дня после ее окончания. Перед взятием материала необходимо воздержаться от мочеиспускания в течение 3-4 часов и половых сношений. Женщины накануне обследования не должны проводить туалет наружных половых органов и спринцевание. Исследуемый материал должен быть без примесей крови. Не следует для исследования брать свободно стекающие уретральные выделения. Секрет простаты следует брать только после окончания острых явлений простатита. При вялотекущей и хронической гонорее перед исследованием необходимо провести провокацию.
Методы провокации при гонорее:
- биологическая: введение гоновакцины (500 млн. микробных тел) взрослым однократно, внутримышечно, детям старше 3-х лет - 100-200 млн. микробных тел; детям до 3-х лет введение гоновакцины не рекомендовано;
- термическая: применение в течение 3-х дней диатермии с абдоминально-вагинально-сакральным расположением электродов по 30, 40, 50 мин или индуктотермии по 10, 15, 20 мин; взятие материала лучше всего провводить из уретры, цервикального канала через 1 час после каждого прогревания;
- механическая: наложение металлического колпачка на шейку матки женщин на 4 часа, проведение массажа уретры у мужчин на буже в течение 10 мин;
- алиментарная: употребление соленой, острой пищи и алкоголя за 24 часа до исследования.
Взятие материала производится после провокации и через 24-48-72 часа.
Для получения наиболее достоверных результатов необходимо проведение повторных исследований.
ТРИХОМОНИАЗ
Материал для исследования Отделяемое из уретры (у мужчин), влагалища, секрет простаты.
Подготовка пациента, взятие биологического материала и условия его транспортировки См. урогенитальный хламидиоз, урогенитальный микоплазмоз.
ТУБЕРКУЛЕЗ (внелегочные локализации)
Материал для исследования Моча, мазки из цервикального канала, уретры.
Подготовка пациента, взятие биологического материала и условия его транспортировки За 10 дней до взятия материала на исследование необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры. См. урогенитальный хламидиоз.
ЗАБОЛЕВАНИЯ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ АССОЦИИРОВАННЫЕ С Mycoplasma pneumoniae
Материал для исследования Мазок из носоглотки.
Особенности взятия мазка из носоглотки Взятие мазка проводится натощак или не ранее, чем через 2-4 часа после еды. При взятии материала необходимо хорошее освещение, пациент сидит против источника света, корень языка придавливают шпателем, материал берут стерильным зондом, не касаясь языка, слизистой щек и зубов и опускают в пробирку с транспортной средой “ДНК-ЭКСПРЕСС”. После взятия материала зонд опускается в пробирку с транспортной средой “ДНК-ЭКСПРЕСС”. После внесения зонда в транспортную среду он несколько раз ротируется, а затем удаляется из пробирки. Пробирка закрывается. Если время транспортировки биологического материала с момента взятия до момента его доставки в лабораторию более 2-х часов, то пробирку необходимо заморозить при -200С. Транспортировка биологического материала должна производиться только в сумке-холодильнике. В замороженном виде биологический материал может храниться не более 2-х недель.
ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ (гастрит, язвенная болезнь желудка или двенадцатиперстной кишки), АССОЦИИРОВАННЫЕ С Helicobacter pylori
Материал для исследования Биоптаты антрального отдела желудка, биоптаты двенадцатиперстной кишки, биоптаты десен, мазки из зубодесневого кармана.
Особенности взятия биопсийного материала
Взятие биопсийного материала проводится во время эндоскопического исследования. Перед началом противохеликобактерной терапии биопсийный образец берется из антрального отдела желудка. При контроле лечения взятие биопсийного образца проводится не ранее чем через 4 недели после проведения противохеликобактерной терапии из тела желудка. Взятый биопсийный образец опускается в стерильную сухую пробирку (эппендорф) и немедленно доставляется в лабораторию. Для более длительного хранения возможна заморозка взятиго биопсийного материала при температуре -20 0 С.
Особенности взятия биоптатов десен, мазков из зубодесневого кармана и слюны
Биопсийный материал из десен, мазки из зубодесневого кармана и слюна берутся у пациентов с гастродуоденальной патологией в анамнезе при наличии у них гингивитов и парадонтоза.
Взятый биопсийный образец опускается в стерильную сухую пробирку (эппендорф) и немедленно доставляется в лабораторию. Для более длительного хранения возможна заморозка взятиго биопсийного материала при температуре -20 0 С.
Мазки из зубодесневого кармана собираются в стерильную пробирку (эппендорф) с физиологическим раствором. В этом случае пробирки могут храниться в холодильнике (+4 0 С- +6 0 С) не более 12 часов, а их транспортировка осуществляется в сумке-холодильнике.
ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ
Herpes Simplex virus II; Citomegalovirus; H. papiloma virus 16, 18
Исследуемый материал- мазки
При герпетической инфекции соскобы лучше всего брать с генитальных поражений (везикул, язвочек). При отсутствии генитальных поражений соскоб берется из цервикального канала. При диагностике цитомегаловирусной инфекции материалом для исследования могут быть, мазок из задней стенки глотки, соскобы из влагалища, уретры и цервикального канала, слюна, спиномозговая жидкость. При диагностике папилломавирусной инфекции материалом для исследования могут быть мазок из носоглотки, с конъюктивы глаза, соскоб из цервикального канала, шейки матки, т.е. слизистых (неороговевабщий эпителий).
Взятие биологического материала Взятие биологического материала повозможности должно проводиться в период обострения инфекции. См. урогенитальный хламидиоз, урогенитальный микоплазмоз.
Herpes Simplex virus I; Herpes Simplex virus II; Herpes Simplex virus VI
Citomegalovirus; Epstein Barr virus
Исследуемый материал Нативная кровь.
Подготовка пациента, взятие биологического материала и условия его транспортировки Кровь на исследование желательно брать натощак.
Венозная кровь в количестве 1-1,5 мл отбирается в стерильную пробирку (эппендорф) объемом 1,5 мл с раствором ЭДТА. Пробирка с кровью может храниться в холодильнике (+4 0 С- +6 0 С) не более 24 часов. Пробирку не замораживать. Исследование будет проводиться из плазмы и форменных элементов крови.
HBV-ДНК; Определение концентрации HBV-ДНК методом конкурентной ПЦР
HCV-РНК (полуколич. оценка) + anti-HCV; HCV-РНК с определением генотипа HCV+ anti-HCV; Hepatitis G; TTV-ДНК
Исследуемый материал Сыворотка крови.
Подготовка пациента, взятие биологического материала и условия его транспортировки Взятие венозной крови и приготовление сыворотки см. в разделе определение концентрации гомонов методом ИФА. Исследованию подлежит cыворотка, не содержащая примеси эритроцитов. В случае необходимости длительного хранения исследуемого образца крови (только для гепатитов B, C, G) необходимо отобрать 1 мл сыворотки или плазмы крови и хранить ее при температуре -20 0 С не более 2-х недель.
КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ
Исследуемый материал Мазки из заднего нижнего свода влагалища.
Для комплексной диагностики бактериального вагиноза необходимо:
Взять соскоб эпителиальных клеток из заднего или бокового свода влагалища на отдельное одноразоаое предметное стекло, подписать и высушить его. Хранить стекло при комнатной температуре.
Удалить слизь и взять соскоб эпителиальных клеток из заднего или бокового свода влагалища одноразовым зондомщеткой типа цервикс-браш в ПЦР-пробирку с реактивом “ДНК-ЭКСПРЕСС”. Хранить пробирку в морозильной камере при температуре минус 20оС до 10 дней.
Предметное стекло и ПЦР-пробирку отправить в лабораторию “Литех” с полностью заполненным направлением.
Взятие биологического материала и условия его транспортировки
См. особенности взятия материала из влагалища для цитологического и ПЦР исследований.
Отбор клинического материала осуществляет медицинский персонал с соблюдением правил противоэпидемического режима, только стерильными одноразовыми инструментариями (шприцы, соответствующие зонды, цитощеточки и пр.), в одноразовых перчатках.
Максимально полно собрать материал из выбранного локуса, используя подходящие для этого аппликаторы – зонды, цитощетки (обеспечить адекватность клинического образца).
Сохранить полученный материал (ДНК/РНК микроорганизмов), используя надежные транспортные среды и консерванты, предоставляемые ПЦР-лабораторией. Среда для транспортировки и хранения клинического материала обеспечивает стабильность РНК и ДНК при комнатной температуре до 28 дней.
Поместить взятый материал в вакуэты с ЭДТА (кровь), в одноразовые химически чистые пробирки «Эппендорф» (мазки, ликвор, биоптат и др.). Основным условием при сборе материала является предотвращение попадания в пробу ДНК-аз и рибонуклеаз, т.к. рибонуклеазы и ДНК-азы – ферменты деградации РНК и ДНК. Они чрезвычайно стабильны в окружающей среде, выдерживают длительное кипячение. Основной источник нуклеаз – кожные покровы, частицы пыли. Пластиковые пробирки и наконечники должны иметь маркировку «DNase, RNase- free» (свободные от нуклеаз).
Сразу после забора плотно закрывать пробирки, флаконы с клиническим материалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек.
При работе с клиническим материалом, открывая пробирки, флаконы, не производить резких движений и не допускать разбрызгивания и расплескивания, что может привести к контаминации проб и рабочих поверхностей.
Для исключения взаимной контаминации образцы хранить и транспортировать в отдельном полиэтиленовом пакете или штативах. При необходимости переноса образца использовать автоматические микропипетки со сменными одноразовыми наконечниками с аэрозольными барьерами.
До транспортировки в ПЦР-лабораторию отобранный биоматериал хранить при температуре 2–4 °С не более 48 часов. Необходимо минимизировать время от забора образца до постановки ПЦР-анализа. Транспортировка образцов осуществляется в сумках-холодильниках, термоконтейнерах, термосах с термопакетами, льдом или сухим льдом.
Кровь, плазма, сыворотка
Забор крови рекомендуется проводить с использованием вакуумных систем. Внедрение таких систем позволяет стандартизировать манипуляции с кровью, положительно сказывается на всех этапах лабораторного исследования и в целом переводит работу лаборатории на иной, более высокий уровень качества. Их использование гарантирует защиту персонала от инфицирования, сокращается время, затрачиваемое на процедуру забора крови, значительно реже сопровождается гемолизом, позволяет сохранить стерильность проб крови и герметично транспортировать.
Венепункцию рекомендуется выполнять натощак из локтевой вены в специальную вакуумную пробирку с антикоагулянтом, после чего пробирка переворачивается для перемешивания несколько раз. Пробирки с кровью хранят в холодильнике при +4 °С – +8 °С. Максимальный срок хранения крови – 1 сутки (не замораживать!). В случае необходимости длительного хранения необходимо отобрать 1 мл сыворотки или плазмы крови и хранить ее при температуре -16 о -20 о С не более 2 недель.
Характеристика вакуумных систем, используемых для ПЦР-диагностики:
Вакуэты с ЭДТА (6 %) – используются для проведения качественных и количественных исследований. ЭДТА-антикоагулянт хорошо фиксирует нуклеиновые кислоты клетки.
Вакуэты с цитратом натрия (3,8 %) – используются для проведения качественных и количественных исследований. Не подходят для длительной транспортировки, т.к. цитрат является хорошей питательной средой для посторонней микрофлоры.
Вакуэты без антикоагулянтов (сыворотка крови) – используются для проведения качественных исследований. Использования сыворотки крови для количественных исследований нежелательно, т.к. часть инфекционного агента оседает в сгустке крови, при этом снижается возможность определения количественного содержания его в крови.
Вакуэты с гепарином - категорически не подходят для ПЦР - реакции. Гепарин является полианионом, как и ДНК, поэтому в ПЦР-реакции конкурирует с ДНК.
Инструкция по сбору, хранению и транспортировке
биологического материала для лабораторных исследований
Биологический материал должен находиться в маркированных пробирках (контейнерах) и сопровождаться заполненным индивидуальным направлением в одном экземпляре. Необходимо тщательно, разборчиво заполнить направление, указав следующие сведения: дату, № пробирки, наименование ЛПУ, направившего на исследование биоматериал, фамилию врача, забравшего материал; ФИО, возраст и пол пациента, предварительный диагноз; при беременности – срок беременности. Прием биологического материала: ПЦР и иммунохимические исследования крови - с 09:00 до 18:00 кроме выходных и праздничных дней. Бактериологические исследования - с 09:00 до 11:00 кроме пятницы, выходных, предпраздничных и праздничных дней. |
для выявления возбудителей заболеваний методом ПЦР
1.1.1. Взятие биоматериала производится из предполагаемого места обитания микроорганизмов и развития инфекции.
1.1.2. Количество забранного материала должно быть небольшим. Избыток отделяемого, слизь и гной отрицательно влияют на качество выделения ДНК и способствуют деградации ДНК при хранении и транспортировке.
1.1.3. При внесении биоматериала, взятого у пациента зондом с ватным тампоном или щеточкой, в пробирку типа эппендорф с буферным раствором, необходимо:
Соблюдать стерильность;
Прежде, чем погружать собранный на тампоне (щеточке) биоматериал в раствор, размазать его по сухой стенке пробирки, затем смочить тампон (щеточку) в растворе и, вращая зонд, тщательно смыть весь материал со стенки пробирки и тампона (щеточки);
По возможности отжать тампон о стенку пробирки, удалить зонд с тампоном (щеточкой) и закрыть пробирку.
1.2. Способы взятия биоматериала для исследований методом ПЦР
1.2.1. Соскобы. Для соскобов используются одноразовые стерильные зонды, имеющие ватный тампон с повышенной адсорбцией или «щеточки», реже - ложки Фолькмана, малые ушные ложки или аналогичные инструменты со слегка затупленными краями. Поскабливающими движениями собрать материал. Исследуемый материал должен содержать возможно большее количество эпителиальных клеток и минимальное количество слизи, примесей крови и экссудата. Внести материал в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором (см. раздел 1.1.).
Соскоб из цервикального канала: перед взятием соскоба необходимо удалить избыток слизи стерильным ватным тампоном, обработать шейку матки стерильным физиологическим раствором. Зонд ввести в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см, избегая соприкосновения со стенками влагалища, и поскабливающим движением (не до крови) собрать материал. Небольшое количество эритроцитов в пробе не влияет на результат анализа. При наличии эрозии шейки матки материал берут с границы здоровой и измененной ткани.
Соскоб из уретры: зонд ввести в уретру (у мужчин - на глубину 2-4 см) и несколькими вращательными движениями собрать материал. Накануне перед взятием материала допускается провокация (острая пища, алкоголь и др.). Рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 1-2-х часов перед взятием пробы. При наличии обильных гнойных выделений соскоб надо брать не позже, чем через 15 минут после мочеиспускания.
Соскоб с конъюнктивы берут, предварительно проведя анестезию глаза 0,5% раствором дикаина. Вывернув веко, зондом с ватным тампоном (либо глазным скальпелем) собрать эпителиальные клетки с конъюнктивы.
Соскоб из прямой кишки: зонд ввести в анальное отверстие на глубину 3-4 см и вращательным движением собрать материал.
1.2.2. Мазки. Одноразовым стерильным зондом с ватным тампоном или щеточкой взять небольшое количество отделяемого (со сводов влагалища, из зева, носоглотки и др.) и перенести в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором (см. раздел 1.1.).
1.2.3. Кровь. Для исследований методом ПЦР кровь должна быть нативной (не свернувшейся).
Кровь собрать асептически, путем венопункции - в фирменную пробирку (2-3 мл) с антикоагулянтом ЭДТА (гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! ), аккуратно перемешать, плавно переворачивая пробирку.
Кровь с ЭДТА является биоматериалом для следующих групп исследований:
- генетические исследования (момент забора крови значения не имеет).
- выявление возбудителей инфекций (наиболее информативными являются пробы, взятые при ознобе, повышенной температуре, т. е. предположительно во время виремии или бактериемии).
1.2.4. Моча. В пустой стерильный контейнер с плотно завинчивающейся крышкой собирают утреннюю первую или среднюю порцию мочи в количестве минимум 10 мл. Если забор мочи проводят днем, то перед этим пациент не должен мочиться 1,5-3 часа.
1.2.5. Мокрота. Утром провести санацию ротовой полости и горла (прополоскать раствором питьевой соды). Собрать мокроту в пустой стерильный широкогорлый флакон.
1.2.6. Биоптат. Взятие материала осуществлять из зоны предполагаемого местонахождения возбудителя инфекции, из поврежденной ткани или пограничного с повреждением участка. Поместить биоптат в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором.
1.2.7. Слюна, желудочный сок, ликвор, синовиальная жидкость. Слюна (1-5 мл), желудочный сок (1-5 мл), ликвор (1-1,5 мл) - поместить в пустую стерильную пробирку (контейнер).
1.2.8. Сок предстательной железы. После массажа предстательной железы сок собирают в количестве 0,5-1 мл в пустую стерильную пробирку (контейнер). При невозможности получить сок, сразу после массажа собирают первую порцию мочи в количестве не более 10 мл (в этой порции содержится сок предстательной железы).
1.2.9. Смывы, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ). Стерильным ватным тампоном и 5-7 мл физиологического раствора проводят смыв, например, с наконечника эндоскопа или бронхоскопа, и помещают 0,5-5 мл смыва в пустую стерильную пробирку (контейнер).
1.2.10. Фекалии. Зонд с ватным тампоном помещают внутрь каловых масс и слегка проворачивают, захватывая небольшое количество материала. Затем материал помещают в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором.
1.3. Правила хранения биологического материала для исследований методом ПЦР
1.3.1. Мазки, соскобы :
В холодильной камере (+4ºС - +8ºС) до 7-и суток;
В морозильной камере (-20ºС) до 14 суток (допускается только однократное размораживание!).
1.3.2. Моча : в холодильной камере (+4ºС - +8ºС) не более 1-х суток;
1.3.3. Кровь с ЭДТА : в холодильной камере (+4ºС - +8ºС) - для определения возбудителей инфекций - не более 1-х суток; для генетических исследований – до 4-х суток. Замораживанию не подлежит.
1.3.4. Мокрота
1.3.5. Биоптаты :
В холодильной камере (+4ºС - +8ºС) не более 1-х суток,
В морозильной камере (-20ºС) до 2-х недель.
1.3.6. Сок предстательной железы : в холодильной камере (+4ºС - +8ºС) не более 1-х суток.
1.3.7. Синовиальная жидкость : в холодильной камере (+4ºС - +8ºС) не более 1-х суток.
2. Правила взятия, хранения и транспортировки крови
для иммунохимических исследований
2.1.1. Накануне взятия крови исключить физические нагрузки, стрессовые ситуации, физиотерапевтические процедуры, прием лекарственных средств (за исключением случаев медикаментозного лечения по назначению врача), оральных контрацептивов, прием спиртных напитков и жирной пищи. Непосредственно перед исследованием не курить.
2.1.2. При исследовании функции щитовидной железы в период лечения препаратами, содержащими гормоны ЩЖ, исследование проводится через 24 ч. после последнего приема препарата; за 2-3 дня до взятия крови исключить прием препаратов, содержащих йод.
2.1.3. При исследовании ПСА за неделю до анализа исключить любые манипуляции с предстательной железой.
2.1.4. Взятие крови производят утром, натощак (во избежание хилёзности, т. е. мутности сыворотки), в условиях физиологического покоя. Перед забором крови пациенту необходимо предоставить 15-минутный отдых.
2.1.5. Взятие крови осуществляют в процедурном кабинете ЛПУ, в положении пациента «сидя» или «лёжа», из локтевой вены с соблюдением правил асептики и антисептики . Кровь собирают в стерильную пробирку, шприц-моновет или cистему для взятия крови (Vacutainer®, Vacuette®).
2.1.6. Для получения сыворотки венозная кровь отстаивается до полного свертывания. После образования фибринового сгустка последний отделяют от стенок стерильной стеклянной палочкой, строго индивидуальной для каждой пробы, пробирку центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин* .
* Шприц-моновет и cистемы для взятия крови (Vacutainer®, Vacuette®) подвергаются центрифугированию без предварительных манипуляций.
2.1.7. Надосадочную жидкость желтого цвета (сыворотку) осторожно переносят пипеткой в пустую пробирку с крышкой (на 5 мл).
2.2. Правила хранения крови и сыворотки крови для иммунохимических исследований
2.2.1. К ровь: в холодильной камере (+40С - +80С) в течение 1-х суток.
2.2.2. Сыворотка крови:
В холодильной камере при температуре +40С - + 80С в течение 4-х суток;
В морозильной камере при температуре -200С в течение 2-х недель.
Допускается только однократное размораживание!
ВНИМАНИЕ! Исследованию подлежит сыворотка, не содержащая примеси эритроцитов, бактериальных проростов, хилёза, гемолиза. При наличии любого из указанных признаков сыворотка уничтожается и назначается повторное взятие крови.
2.3. Правила взятия и хранения крови для исследования волчаночного антикоагулянта
и коагулогических исследований
2.3.1. Взятие крови производится утром натощак из локтевой вены с соблюдением правил асептики и антисептики в день выполнения исследования. Для предотвращения активации свертывания крови компрессия вены не должна превышать 1 минуту.
2.3.2. Если исследование назначается на фоне приема препаратов, влияющих на свертывание крови, необходимо отметить это в направлении.
2.3.3. Кровь собирают в специальную пробирку, содержащую цитрат натрия , до отметки. При несоблюдении этого правила изменяется соотношение кровь/антикоагулянт, что может отрицательно сказаться на точности результата.
2.3.4. В течение 1 ч. после взятия крови пробирку необходимо отцентрифугировать при 3000 об/мин в течение 15 минут.
2.3.5. Хранение плазмы: до 6 часов при температуре +40С - +80С или до 2-х недель при температуре -200С.
2.4. Правила взятия и хранения крови для исследования гликированного (гликозилированного) гемоглобина
2.4.1. Взятие крови производится утром натощак из локтевой вены, соблюдая правила асептики и антисептики.
2.4.2. Кровь собирают в специальную пробирку, содержащую ЭДТА, плавно перемешивают. Не центрифугировать!
2.4.3. Доставка в Лабораторию в день взятия крови.
2.4.4. Хранение: до 2-х недель при температуре -200С.
2.5. Правила проведения пренатального скрининга
2.5.1. Оптимальные сроки проведения исследования: I триместр – 10-13 недель беременности; II триместр – 16-18 недель беременности.
2.5.2. При направлении на исследование заполняется специальное направление, в котором необходимо указать индивидуальные данные беременной женщины: возраст (число/месяц/год), вес, результаты УЗИ (КТР, БПР, количество плодов, срок беременности по УЗИ (недели+дни); если имеются - данные о величине шейной складки - NT) с обязательным указанием даты УЗИ и ФИО врача, проводившего УЗИ; наличие дополнительных факторов риска (курение, сахарный диабет, ЭКО), этническая принадлежность.
2.5.3. Для скрининга II триместра беременности можно использовать данные УЗИ, проведенного в I триместре.
3. Правила взятия, хранения и транспортировки биоматериала
для бактериологических исследований
3.1. Взятие биоматериала производят до применения курса антибактериальной терапии или не менее, чем через неделю после ее завершения.
3.2. Для предупреждения контаминации пробы микроорганизмами из внешней среды взятый биоматериал переносят в пустой контейнер или пробирку с транспортной средой с соблюдением стандартных правил стерильности: пробка пробирки (контейнера) открывается/закрывается так, чтобы внутренняя часть пробки осталась стерильной, стерильная посуда открытой держится недолго.
3.3. Взятие биоматериала для выявления микоплазм и уреаплазм, трихомонад, гонококков, неспецифической микрофлоры , культур анаэробных бактерий производится в фирменные пробирки с угольной транспортной средой:
Упаковку открыть в указанном месте согласно схеме;
Пробирку вынуть и открыть, крышку выбросить;
Зондом взять соскоб/мазок, биоптат или обмакнуть зонд в биологическую жидкость;
Зонд с биоматериалом сразу поместить в пробирку (ручка зонда является крышкой пробирки);
Пробирку пронумеровать, номер указать в направлении.
3.4. Виды биологического материала для взятия в транспортную угольную среду: мазки/соскобы, сок предстательной железы, ликвор, синовиальная жидкость, биоптат.
3.5. Хранение биоматериала в пробирках с транспортной средой для выявления микоплазм и уреаплазм, неспецифической микрофлоры до момента транспортировки -
Доставка в Лабораторию в течение одних суток.
3.6. Хранение биоматериала в пробирках с транспортной средой для выявления трихомонад, гонококков, культур анаэробных бактерий до момента транспортировки - при комнатной температуре.
3.7. Нативный биоматериал: мокроту, сок предстательной железы, синовиальную жидкость от 1 до 10 мл для выявления неспецифической микрофлоры, микоплазм и уреаплазм собирают в пустой стерильный контейнер.
Необходимо оповестить Лабораторию накануне или в день взятия биоматериала до 11:00.
Хранение нативного биоматериала до момента транспортировки - в холодильной камере (+4ºС - +8ºС).
Доставка в Лабораторию в день взятия материала.
3.8. Мочу для исследования на степень бактериурии (утренняя средняя порция, 10-20 мл) собирают в пустой стерильный контейнер с крышкой после тщательного туалета наружных половых органов.
Необходимо оповестить Лабораторию накануне или в день взятия биоматериала до 11:00.
Хранение биоматериала до момента транспортировки - в холодильной камере (+4ºС - +8ºС).
Доставка в Лабораторию в день взятия биоматериала.
3.9. Кровь на стерильность .
Наиболее информативной является проба крови, взятая во время подъема температуры.
Кровь собирают в фирменные флаконы с двухфазной транспортной средой (флакон для взрослых, флакон для детей). Пластмассовую крышку флакона аккуратно вскрыть, появившуюся часть резиновой пробки протереть 70%-м спиртом. В стерильных условиях шприцем взять кровь из вены и ввести через резиновую пробку во флакон (4 мл - во флакон для взрослых, 2 мл - во флакон для детей).
Необходимо оповестить Лабораторию накануне или в день взятия биоматериала до 11:00.
Хранение крови до момента транспортировки - при комнатной температуре.
Доставка в Лабораторию в день взятия биоматериала.
3.10. Грудное молоко для выявления неспецифической микрофлоры берется из каждой груди в отдельный стерильный герметично закрывающийся стаканчик. Подписать стаканчики: «левая грудь», «правая грудь».
Перед сбором биоматериала грудь помыть теплой водой с мылом, вытереть чистым полотенцем, тщательно обработать соски и околососковую область ватным тампоном, смоченным 70% раствором этилового спирта, просушить стерильной салфеткой (каждая железа обрабатывается отдельным тампоном). Первые 10-15 мл сцеженного молока для анализа не используются. Вторую порцию молока из каждой груди сцедить в подписанный стаканчик в количестве ~ 10 мл.
Необходимо оповестить Лабораторию накануне или в день взятия биоматериала до 11:00.
Доставка в Лабораторию в течение 2-х часов в день взятия материала.
3.11. Кал на дисбактериоз .
Перед взятием пробы запрещается употребление алкоголя в течение 3-х суток и прием антибиотиков в течение 2-х недель. Стул необходимо получить без клизм и слабительных. Детям при запорах можно использовать для раздражающего эффекта кусочек мыла. Фекалии собирают в индивидуальное судно, отмытое от дезинфектанта. Стерильной ложкой отбирают 3-5 г средней порции кала и помещают в стерильный контейнер.
Необходимо оповестить Лабораторию накануне или в день взятия биоматериала до 11:00.
Хранение до момента транспортировки - контейнер с биоматериалом для сохранения тепла хранить обернутым в вату и бумагу.
Доставка в Лабораторию в день взятия биоматериала.
4. Правила взятия, хранения и транспортировки биоматериала
для микроскопических исследований
4.1. От каждого пациента - 2 стекла (одно стекло – запасное). На каждом стекле - 3 точки: влагалище (V ), цервикальный канал (С ), уретра (U ). Наносить мазки так, чтобы матовая поверхность была слева, сверху, и от нее – слева направо: v, c, u.
4.2. Маркировка (№) на стекле не должна растворяться в спирте (можно подписывать на матовой части стекла простым карандашом). Мазки должны быть зафиксированы посредством высушивания на воздухе (30-60 мин).
4.3. Стекла должны быть промаркированы, сложены мазками друг к другу, упакованы в индивидуальный пакет с соответствующей сопроводительной надписью (ЛПУ, Ф. И.О. пациента, № на стекле).
4.4. Пакет и заполненное направление передаются в Лабораторию.
5. Правила взятия, хранения и транспортировки биоматериала
5.1. В течение 24-х часов перед исследованием необходимо исключить спринцевание, применение интравагинальной терапии и половые контакты. Нельзя брать материал во время менструации. Наиболее информативными являются пробы, взятые на 14-20 дни после начала менструации.
5.2. Материал берется до бимануального исследования, проведения различных диагностических проб, до взятия материала на ПЦР. Взятие материала осуществляется без предварительной обработки слизистой влагалища.
5.3. Соскоб со слизистой влагалища/цервикального канала берется нейлоновой щеточкой Cervex-Brush, шпателем или другим инструментом и равномерно распределяется по стеклу, оставляя один конец стекла чистым (для маркировки). На стекло берется одна точка, дублируется еще на одно запасное стекло (всего два стекла на одну точку). Мазки должны быть зафиксированы посредством высушивания на воздухе (30-60 мин).
5.4. Стекла должны быть промаркированы (№ и Ф. И.О. пациента), сложены мазками друг к другу, упакованы в индивидуальный пакет с соответствующей сопроводительной надписью (ЛПУ, Ф. И.О. пациента, № на стекле).
5.5. Хранить высушенные мазки можно до 6 дней при комнатной температуре.
5.6. Пакет и заполненное направление (на каждую точку свое направление с указанием вида биоматериала) передаются в Лабораторию.
Не вкладывать направление в пакет со стеклами, не заворачивать стекла в направление!
Оптимальное время исследования крови – в интервале от 1 до 4 часов после взятия.В промежутке от 5 до 30 минут происходит временная адаптации тромбоцитов к антикоагулянту и их агрегация, что может привести к их ложному снижению в пробе крови.
Нежелательно исследовать кровь позднее 8 часов после взятия, т.к. изменяются некоторые характеристики клеток: снижается объем лейкоцитов, повышается объем эритроцитов, что в конечном итоге приводит к ошибочным результатам измерения и неправильной интерпретации результатов. Только концентрация гемоглобина и количество тромбоцитов остаются стабильными в течение суток хранения крови.
Кровь нельзя замораживать. Капиллярную кровь с К 2 ЭДТА следует хранить при комнатной температуре и анализировать в течение 4 часов после взятия.
При необходимости проведения отсроченного анализа (транспортировка на отдаленные расстояния, техническая неполадка прибора и т. д.), пробы крови хранят в холодильнике (4 о – 8 о С) и исследуют в течение 24 часов. Однако при этом следует учитывать, что происходит набухание клеток и изменение параметров, связанных с их объемом. У практически здоровых людей эти изменения не носят критического характера и не сказываются на количественных параметрах, но при наличии патологических клеток, последние могут изменяться или даже разрушаться в течение нескольких часов с момента взятия крови.
Непосредственно перед исследованием кровь должна быть тщательно перемешана в течение нескольких минут для разведения антикоагулянта и равномерного распределения форменных элементов в плазме. Длительное постоянное перемешивание образцов до момента их исследований не рекомендуется вследствие возможного травмирования и распада патологических клеток.
Исследование крови на автоматическом анализаторе проводится при комнатной температуре. Кровь, хранившуюся в холодильнике, необходимо вначале согреть до комнатной температуры, так как при низкой температуре увеличивается вязкость крови, и форменные элементы имеют тенденцию к склеиванию, что в свою очередь, приводит к нарушению перемешивания и неполному лизису. Исследование холодной крови может быть причиной появления «сигналов тревоги» вследствие компрессии лейкоцитарной гистограммы.
При выполнении гематологических исследований на значительном удалении от места взятия крови неизбежно возникают проблемы, связанные с неблагоприятными условиями транспортировки. Воздействие механических факторов (тряска, вибрация, перемешивание и т.д.), температурного режима, вероятность пролива и загрязнения проб могут оказывать влияние на качество анализов. Для устранения этих причин при перевозках пробирок с кровью рекомендуется использовать герметично закрытые пластиковые пробирки и специальные транспортные изотермические контейнеры. Во время транспортировки не допускается контакт образца (с нативным материалом) и бланка-направления, в соответствии с правилами биологической безопасности.
^ 4.3. Прием и регистрация биологического материала
Пробирки с образцами венозной крови доставляют в лабораторию в день взятия в в штативах в специальных сумках-саквояжах для доставки биологического материала, в которых пробирки должны находиться в вертикальном положении, а при транспортировке на удаленное расстояние - в специальных контейнерах.
Сотрудник лаборатории, принимающий материал, должен проверить:
Правильность оформления направления: в бланке–направлении указываются данные обследуемого (фамилия, имя и отчество, возраст, № истории болезни или амбулаторной карты, отделение, диагноз, проведенная терапия);
Маркировку пробирок с образцами крови (на них должны быть нанесены код или фамилия больного, идентичные коду и фамилии в бланке направления материала для исследования). Лаборант должензарегистрировать доставленный материал, отметить количество пробирок.
^ 4.4 Подсчет клеточного состава крови на гематологическом анализаторе
Подсчет клеточного состава крови на гематологическом анализаторе должен проводиться в строгом соответствии с инструкцией к прибору.
При работе на гематологическом анализаторе следует:
Использовать кровь, стабилизированную К- 2 ЭДТА в рекомендованной пропорции для конкретной соли и одноразовые пробирки для гематологических исследований (простых или вакуумных);
Перед анализом осторожно, но тщательно перемешать пробирку с кровью (рекомендуется для этой цели использовать устройство для перемешивания образцов крови - ротомикс);
Использовать реактивы, зарегистрированные в установленном порядке; при смене реактивов на продукцию другого производителя следует проверить и установить калибровку прибора;
Запускать прибор, соблюдая все стадии промывки, добиваясь нулевых (фоновых) значений показателей по всем каналам;
Обращать внимание на сообщения прибора о вероятных систематических ошибках: помнить, что увеличение МСНС выше нормальных значений, как правило, результат ошибки измерения;
При выявлении ошибки обязательно устранить причину, не работать на неисправном приборе;
Выполнять процедуру контроля качества по соответствующей программе. с оценкой полученного результата;
Работать осмысленно, сопоставляя получаемые результаты с клинической характеристикой проб больного;
После окончания измерений тщательно промыть анализатор;
При остановке прибора на длительный срок обязательно выполнить все процедуры консервации (по возможности совместно с сервис-инженером);
При возникновении технических проблем следует воспользоваться помощью сервис-инженера фирмы, имеющей лицензию на техническое обслуживание; не доверять работу необученному персоналу.
Приступая к работе на гематологическом анализаторе, следует учесть границы линейности измерения анализируемых параметров. Оценка проб со значениями анализируемых параметров, превышающих границу линейности измерения, может привести к ошибочным результатам. В большинстве случаев при анализе проб с гиперцитозами анализатор вместо значения измеряемого параметра выдает значок "D" (dilute), что указывает на необходимость разведения пробы и повторного измерения. Разведение необходимо проводить до тех пор, пока не будут получены схожие итоговые результаты при двух ближайших разведениях.
^ П р и м е р ─ Анализ пробы больного с гиперлейкоцитозом на трех различных гематологических анализаторах представлен в таблице.
Таблица 3
¦Результаты подсчета количества при гиперлейкоцитозе, выполненные на трех различных гематологических анализаторах
| ^ Гематологические анализаторы | Степень разведения пробы | Итоговое значение |
|||
| ^ Цельная кровь | 1:1 | 1:3 | 1:4 | WBC |
|
| 1 | D | 274,5 | 274,5 | 143,1 | 715,5 |
| 2 | 322,6 | 253,2 | 177,7 | 141,8 | 709,0 |
| 3 | D | D | 168,3 | 139,1 | 695,5 |
Из таблицы видно, что при анализе цельной крови только один анализатор (2-й) дал цифровое значение количества лейкоцитов, два других указали на необходимость разведения пробы. Последующее поэтапное измерение пробы в трех разведениях позволило добиться близких конечных результатов на всех приборах только при разведении 1:3 и 1:4. Таким образом, итоговое количество лейкоцитов составило 700,0 - 710,0 x 10 9 /л, что более чем в 2 раза превышает первоначальное значение, полученное в цельной крови на 2-м анализаторе и в 1,5 - при разведении 1:1 на 1-м и 2-м анализаторах.
^ Калибровка гематологических анализаторов
Которой достигается равенство нулю систематической составляющей погрешности (нулевое смещение) или подтверждается, что смещение равно нулю с учетом погрешности калибровки. Калибровка гематологических анализаторов может быть выполнена двумя основными способами:
По цельной крови;
По образцам стабилизированной крови с аттестованными значениями.
^ 5.1 Калибровка по цельной крови
Калибровка по цельной крови может быть выполнена путем сравнения с референтным анализатором, калибровка которого верифицирована и может быть принята за исходную.
Для калибровки путем сравнения с референтным анализатором используется 20 образцов венозной крови пациентов, выбранных произвольно из дневной программы исследований лаборатории, располагающей референтным анализатором. Кровь должна быть взята в вакуумные пробирки с антикоагулянтом К 2 ЭДТА. После анализа на референтном анализаторе пробирки с кровью доставляются лабораторию для анализа на калибруемом приборе. Время между измерениями на референтном и калибруемом анализаторе не должно превышать 4 часа. Анализ калибровочных проб на калибруемом приборе должен выполняться таким же способом, как и анализ проб пациентов. Полученные результаты заносятся в таблицу по форме, приведенной в Приложении 1. Данные результаты используются для определения соответствующих калибровочных факторов, которые численно равны коэффициентам наклона калибровочных прямых, проходящих на графике через начало координат.
Калибровочные факторы рассчитываются на компьютере с использованием программы EXCEL, входящей в состав пакета Microsoft OFFICE любой версии. Для расчета калибровочных факторов в данной программе строится точечная диаграмма, где по оси Х откладываются измеренные значения, по оси Y – референтные, задается линия регрессии через начало координат. Программа рисует калибровочную прямую и определяет ее наклон, который и является искомым калибровочным фактором. При выявлении грубых ошибок – точек значительно отстоящих на графике от калибровочной прямой, их необходимо удалить из расчета (стереть всю строку в таблице EXCEL). Полученный калибровочный фактор заносится в таблицу Приложения 1 и используется для ручной корректировки калибровки прибора в соответствие с его инструкцией по эксплуатации.
^ Калибровка по образцам стабилизированной крови с аттестованными значениями
Во всех случаях, когда возможно, следует использовать калибраторы, специально предназначенные изготовителем для калибровки конкретного типа анализатора. Погрешности установленных значений в современных гематологических калибраторах в основном соответствуют медицинским требованиям. Однако не для всех типов анализаторов такие калибраторы имеются. Кроме того, ввиду ограниченного срока сохранности (как правило, не более 45 дней) не всегда имеется возможность получать непросроченные образцы.
Контрольные материалы не предназначены изготовителем для целей калибровки: допуски для значений значительно шире, методы аттестации и производственного контроля не такие строгие как для калибраторов. При проведении калибровки, контрольные материалы могут быть использованы лишь как один из источников информации о метрологических свойствах прибора.
Следует, однако, иметь ввиду, что при использовании для целей калибровки как контрольных материалов, так и калибраторов, особенности пробоподготовки и эксплуатации анализаторов оказывают существенное влияние на составляющие систематической погрешности. Данные влияющие факторы не могут быть учтены при калибровке коммерческими материалами. Вследствие этого, во всех случаях, проведенная калибровка должна быть верифицирована путем анализа статистики получаемых результатов в пробах пациентов (эритроцитарные индексы, интервалы нормальных значений).
5.2.1 Периодичность калибровки гематологических анализаторов
Требования к периодичности калибровки обычно содержатся в инструкции по эксплуатации анализатора. Как правило, калибровка требуется после ремонта или в случае выявления значимого дрейфа в процедурах внутрилабораторного контроля качества.
5.2.2 Процедура калибровки
Процедура калибровки выполняется в соответствии с инструкцией по эксплуатации анализатора.
5.2.3 Контроль результата калибровки
Данный контроль заключается в анализе калибровочного образца сразу после выполнения калибровки. Выполненная калибровка принимается, если результаты анализа соответствуют калибровочным значениям с учетом аналитической вариации анализатора.
5.2.4 Верификация калибровки с помощью эритроцитарных индексов
В этом способе проверки и уточнения калибровки используется тот факт, что средние значения эритроцитарных индексов – МСНС, МСН и MCV по пациентам имеют довольно малую вариацию и поэтому могут эффективно использоваться для контроля калибровки и дальнейшего контроля качества. Рекомендуемое число проб для усреднения равняется 20. Для определения среднего значения МСНС могут быть использованы любые пробы пациентов, в то время, как для определения средних МСН и MCV следует исключать пациентов с анемиями.
Многие современные гематологические анализаторы имеют встроенные программы расчета текущих средних, что значительно облегчает обработку данных.
Целевые значения эритроцитарных индексов при усреднении по 20 пробам пациентов в возрасте от 18 до 60 лет независимо от пола приведены в таблице 4.
Таблица 4
Целевые значения эритроцитарных индексов
Если полученные средние значения вышли за контрольный допуск, то это означает, что калибровка MCV или Hgb или RBC нуждается в корректировки.
При выяснении причин неудовлетворительной калибровки по результатам исследования эритроцитарных параметров при использовании коммерческих калибровочных/контрольных материалов следует принимать во внимание следующую оценку надежности аттестованных значений материалов:
Наиболее точным и стабильным во времени параметром является концентрация эритроцитов;
Стабильным параметром является Hgb, но он может зависеть от применяемых реактивов (например, циановые или бесциановые);
Самым нестабильным параметром является MCV. Значение MCV имеет тенденцию к изменению в течение всего срока годности материала в довольно широком интервале значений. При уточнении калибровки по MCV данные, полученные из анализа средних по эритроцитарным индексам, имеют приоритет над аттестованными значениями в образцах стабилизированной крови.
Считая калибровку по RBC правильной, в таблице 5 указаны возможные причины выхода средних значений индексов за контрольный допуск.
Таблица 5
Причины выхода за пределы средних значений эритроцитарных индексов
| Эритро-цитарные индексы | Среднее значение индекса | Среднее значение индекса | Среднее значение индекса | Среднее значение индекса |
| MCHC | Ниже границы | Выше границы | Выше границы | Ниже границы |
| MCH | В границах допуска | В границах допуска | Выше границы | Ниже границы |
| MCV | Выше границы | Ниже границы | В границах допуска | В границах допуска |
| Причина | Завышен MCV | Занижен MCV | Завышен Hgb | Занижен Hgb |