Номенклатура
Номенклатура была предложена на 1-й Международной конференции по антигенам дифференцировки лейкоцитов человека (Париж , ). Система создана для упорядочивания большого количества моноклональных антител к эпитопам на поверхности лейкоцитов, полученных в лабораториях во всём мире. Таким образом, определённый CD-антиген приписывается к группе моноклональных антител (необходимо наличие, по крайней мере, двух различных клонов), которые распознают один и тот же эпитоп на поверхности клетки. CD-антигеном также называют и непосредственно сам белок -маркер, с которым реагируют данные антитела. Следует отметить, что данная номенклатура классифицирует кластеры безотносительно клеточной функции белка. Нумерация идёт в хронологическом порядке от ранее описанных антигенов к более поздним.
В настоящее время данная классификация значительно расширена и включает не только лейкоциты , но и другие типы клеток . Более того, многие CD-антигены являются не поверхностными, а внутриклеточными белками-маркерами. Некоторые из них являются не белками, а поверхностными углеводами (например, CD15). Насчитывается более 320 антигенов и их подтипов.
Иммунофенотипирование
Система кластеров дифференцировки применяется в иммунофенотипировании для отнесения клеток к тому или иному типу по представленным на клеточных мембранах молекулам-маркёрам. Наличие определённых молекул может быть ассоциировано с соответствующими иммунными функциями. Хотя наличие одного типа CD обычно не позволяет точно определить популяцию клетки (за исключением нескольких примеров), сочетания маркёров позволяют определить её достаточно чётко.
СD -молекулы, используемые для сортировки клеток в различных методах, таких как проточная цитометрия .
| Тип (популяция) клеток | CD-маркеры |
| Стволовые клетки | CD34 +, CD31 - |
| Все лейкоциты | CD45 + |
| Гранулоциты | CD45+, CD15 + |
| Моноциты | CD45+, CD14 + |
| T-лимфоциты | CD45+, CD3 + |
| Т-хелперы | CD45+, CD3+, CD4 + |
| Цитотоксические Т-лимфоциты | CD45+, CD3+, CD8 + |
| B-лимфоциты | CD45+, CD19 + или CD45+, CD20 + |
| Тромбоциты | CD45+, CD61 + |
| Естественные киллеры | CD16+, CD56 +, CD3- |
Два наиболее широко используемых CD -маркера - CD4 и CD8 , которые соответственно являются характерными для T-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов . Эти молекулы определяются в сочетании с CD3+, так и с другими маркерами для других популяций клеток (некоторые макрофаги экспрессируют низкие уровни CD4;
Экспрессируют особые у каждой субпопуляции поверхностные молекулы, которые могут служить маркерами (метками). Значительная часть этих маркеров легко идентифицируется с помощью моноклональных антител . Разработана систематизированная номенклатура маркерных молекул; в ней группы моноклональных антител, каждая их которых специфических связывается с определенной маркерной молекулой, обозначены символом (Claster Designation). За основу CD-номенклатуры принята специфичность прежде всего мышиных моноклональных антител к лейкоцитарным антигенам человека. В создании этой классификации участвуют многие специализированные лаборатории. Моноклональные антитела совпадающей специфичности связывания объединяют в одну группу, присваивая ей номер в системе CD. Однако в настоящее время принято таким образом обозначать не группы антител, а маркерные молекулы, распознаваемые антителами.
Компоненты клеточной поверхности относятся к различным семействам, гены которых произошли, вероятно, от нескольких предковых. Основными из этих семейств являются:
Сеперсемейство рецепторов для фактора некроза опухолей (ФНО) ;
Суперсемейство лектинов C-типа, например, CD23 ;
Суперсемейство многодоменных трансмембранных рецепторных белков (например, рецептор ИЛ-6).
Поскольку набор антигенов клеточной поверхности лимфоцитов зависит не только от типа и стадии дифференцировки клеток, но и от их функционального состояния, с помощью моноклоналнальных антител можно не только различить разные лимфоциты, но и отличить покоящиеся клетки от активированных. Антигены клеточной поверхности, выявляемые с помощью моноклональных антител, принято называть кластерами дифференцировки. Кластер моноклональных антител , реагируя со специфическими полипептидами на поверхности B- и T-лимфоцитов, макрофагов , нейтрофилов и , выявляют их поверхностные маркеры, называемые CD (Claster Determinant). К началу 90-х годов число CD-специфичностей лейкоцитов приближалось к 80(!). Наиболее существенные маркеры T-лимфоцитов - это CD2 ( T11), CD3 ( T3), CD4 ( T4), CD5 ( T1) и CD8 ( T8).
Антигены CD имеют белковую природу и играют важную роль в иммунном ответе. Дифференцировочным антигенам по номенклатуре Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) дается название плюс порядковый номер. Аббревитатура CD, расшифровывываемая как кластер дифференцировки, обозначает группу антител, распознающих одну и ту же или близкие антигенные детерминанты, но может использоваться и для обозначения самого антигена - молекулы, распознаваемой соответствующей группой антител.
Необходимо отметить, что ряд поверхностных молекул
Понятием кластер дифференцировки (от англ. cluster of differentiation, cluster designation; CD) обозначают номенклатуру дифференцировочных антигенов человеческих лейкоцитов. Данная классификация была принята с целью исследования и идентификации поверхностного мембранного белка лейкоцитов в 1982 году. CD-антигенами или, другими словами, CD-маркерами являются белки, которые служат лигандами, либо рецепторами, участвуют во взаимодействиях клеток и являются компонентами каскада установленных сигнальных путей. Данные белки способны выполнять и другие функции (в частности, белок клеточной адгезии). Перечень включенных в номенклатуру антигенов кластеров дифференцировки регулярно пополняется и на сегодня составляет свыше 320 CD-антигенов, а также их подтипов.
Рис. 1.
Номенклатура кластеров дифференцировки была разработана на первой конференции (Париж. 1982 г.) по антигенам дифференцировки человеческих лейкоцитов. Назначением созданной системы стало упорядочивание значительного числа моноклональных антител по отношению к поверхностным эпитопам лейкоцитов, выработанных во многих лабораториях мира.
Было решено, что каждый CD-антиген будет приписан к определенному ряду моноклональных антител (при наличии хотя бы двух неодинаковых клонов), способных распознавать определенный эпитоп на клетке. Название CD-антиген распространилось также и на белок-маркер, в реакцию с которым вступают антитела. Характерно, что описанная номенклатура производит классификацию кластеров дифференцировки, не касаясь клеточных функций белка. Нумерация ведется от антигенов описанных раньше к описанным позже в порядке хронологии.
Со временем данную классификацию значительно расширили, включив в нее и другие разновидности клеток помимо лейкоцитов. Было установлено, что многие из CD-антигенов относятся не к поверхностным, а к внутриклеточным белкам-маркёрам. Некоторые из CD-антигенов были отнесены не к белкам, а к поверхностным углеводам.
Кластеры дифференцировки являют собой моноклональные группы антител способные выявлять присутствие одноименных молекул на поверхностях клеток. Каждую молекулу мембраны принято обозначать как CD, ей присваивается соответствующий номер. Некоторые CD обозначаются символом "w" (от workshop - рабочая группа, англ), свидетельствующим, что данный антиген охарактеризован не полностью.
Возможность идентификации кластеров дифференцировки появилась только с началом полномасштабного использования в опытах моноклональных антител - мАт, которые применяются в технологии проточной цитометрии. Исходя из того, что основная задача в исследованиях экспрессии антигена - обнаружение позитивных клеток различного происхождения, считается, что сходные картины мечения, которые показывают мАт, свидетельствуют о мечении ими одного и того же антигена.
Подобные исследования были начаты в 1980 году. Результатом их стало введение общей CD-номенклатуры не только для человеческих антигенов, но и для антигенов гомологичного характера различных видов животных. Вне сомнения, важнейшим и одним из первых следствий введения CD-номенклатуры явилась возможность обнаружения уникального ряда антигенов с последующим их изучением, клонированием, исследованием условий функциональных вариантов, экспрессии и т.д.
Появилась возможность как фундаментального использования CD-номенклатуры, так и направленного влияния на реализацию некоторых функций изучаемой клетки посредством применения мАт к определенному CD-антигену. Например, то, что CD4 является маркером (преимущественно) для Т-хелперов позволило показать значение данного маркера в процессе отмены смешанных лимфоцитарных реакций и блокады некоторых заболеваний аутоиммунного характера in vivo, используя aHTH-CD4 мАт. Другой пример: анти-СШ мАт успешно активирует Т-клетки.
Как видим, возможность определить экспрессию кластера дифференцировки антигенов для различных состояний определенных клеточных типов позволила установить причины подавляющих и активирующих воздействий, что открывает перспективы моделирования нужных состояний in vivo.
Метод определения Иммунофенотипирование (проточная цитофлюориметрия, безотмывочная технология)
Исследуемый материал Цельная кровь (с ЭДТА)
Доступен выезд на дом
В профиль входят следующие показатели:
- Лимфоциты, абсолютное значение,
- Т-лимфоциты (CD3+),
- Т-хелперы (CD3+CD4+),
- Т-цитотоксические лимфоциты (CD3+CD8+),
- Иммунорегуляторный индекс (CD3+CD4+/CD3+CD8+),
- В-лимфоциты (СD19+),
- ЕК-клетки (CD3-CD16+CD56+),
- Т-ЕК-клетки (CD3+CD16+CD56+).
Лимфоциты экспрессируют ряд поверхностных и цитоплазматических антигенов, уникальных для своей субпопуляции и стадии развития. Физиологическая роль их может быть различной. Эти структуры являются мишенями при иммунофенотипировании лимфоцитов как антигенные маркёры различных субпопуляций, присутствие которых определяют с помощью меченых моноклональных антител. Поверхностные антигенные структуры на клетках, выявляемые моноклональными антителами, назвали кластерами дифференциации (CD, clusters of differentiation). Кластерам дифференциации в целях стандартизации присвоены определённые номера. Используя флюорохром-меченые моноклональные антитела, связывающиеся с определёнными CD, можно произвести подсчёт содержания лимфоцитов, относящихся к различным по функции или стадии развития субпопуляциям. Это позволяет понять природу некоторых заболеваний, оценить состояние пациента, следить за течением и прогнозировать дальнейшее развитие заболевания.
Основные субпопуляции лимфоцитов
Т-лимфоциты - лимфоциты, созревание которых происходит в тимусе (отсюда их название). Они участвуют в обеспечении клеточного иммунного ответа и контролируют работу В-лимфоцитов, ответственных за образование антител, т. е. за гуморальный иммунный ответ.
Т-хелперы (от англ. «to help» – помогать) – разновидность Т-лимфоцитов, несут на своей поверхности структуры, способствующие распознаванию антигенов, презентированных вспомогательными клетками, участвуют в регуляции иммунного ответа, вырабатывая различные цитокины.
Цитотоксические Т-клетки - распознают фрагменты антигена на поверхности клеток-мишеней, ориентируют свои гранулы по направлению к мишени и высвобождают их содержимое в области контакта с ней. При этом некоторые цитокины являются сигналом гибели (по типу апоптоза) для клеток-мишеней.
В-лимфоциты (от лат. «bursa» - сумка, по названию сумки Фабрициуса, в которой созревают эти лимфоциты у птиц) - проходят развитие в лимфоузлах и других периферических органах лимфоидной системы. На поверхности эти клетки несут иммуноглобулины, функционирующие как рецепторы к антигенам. В ответ на взаимодействие с антигеном В-лимфоциты отвечают делением и дифференциацией в плазматические клетки, вырабатывающие антитела, посредством которых обеспечивается гуморальный иммунитет.
ЕК-клетки (естественные киллерные клетки, или натуральные киллеры) – клетки с естественной, неиммунной цитотоксической активностью к неопластически изменённым клеткам-мишеням. ЕК-клетки не относятся ни к зрелым Т- или В-лимфоцитам, ни к моноцитам.
Т-ЕК (ЕКТ)-клетки – это клетки с естественной неиммунной киллерной активностью, имеющие признаки Т-лимфоцитов.
Кластеры дифференциации антигенов
CD3 – поверхностный маркёр, специфичный для всех клеток субпопуляции Т-лимфоцитов. По функциям относится к семейству белков, формирующих комплекс мембранной передачи сигнала, связанный с Т-клеточным рецептором.
CD4 – характерен для хелперных Т-клеток; представлен также на моноцитах, макрофагах, дендритных клетках. Он связывается с молекулами MHC класса II, экспрессированными на антигенпрезентирующих клетках, облегчая распознавание пептидных антигенов.
CD8 – характерен для супрессорных и/или цитотоксических Т-клеток, ЕК-клеток, большей части тимоцитов. Это рецептор Т-клеточной активации, который облегчает распознавание клеточно-связанных антигенов MHC класса I (major histocompatibility complex - главный комплекс гистосовместимости).
CD16 – используется вместе с CD56 преимущественно для идентификации ЕК-клеток. Представлен также на макрофагах, тучных клетках, нейтрофилах, некоторых Т-клетках. Это компонент рецепторов, связанных с IgG, опосредующих фагоцитоз, продукцию цитокинов и антителозависимую клеточную цитотоксичность.
CD19 – присутствует на B-клетках, их предшественниках, фолликулярных дендритных клетках, считается самым ранним маркёром B-клеточной дифференциации. Регулирует развитие, дифференциацию и активацию B-клеток.
CD56 – прототипный маркёр ЕК-клеток. Помимо ЕК-клеток присутствует на эмбриональных, мышечных, нервных, эпителиальных клетках, некоторых активированных Т-клетках. CD56-позитивны такие гематологические опухоли, как ЕК-клеточная или Т-клеточная лимфома, анапластическая крупноклеточная лимфома, плазмоклеточная миелома (плазмоклеточная лейкемия CD56-негативна). Это молекулы адгезии клеточной поверхности, которые облегчают гомофильную адгезию и участвуют в контактном ингибировании роста, ЕК-клеточной цитотоксичности, развитии нервных клеток.
Литература
- Зурочка А.В., Хайдуков С.В. и др. - Проточная цитометрия в медицине и биологии. - Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2013. – 552 с.
- Клиническая иммунология и аллергология / Ред. Лолор-младший Г., Фишер Т, Д. Адельман Д../: Пер. с англ. - М.: Практика, 2000. - 806 с.
- Клиническая лабораторная диагностика. Национальное руководство. Том 2./Ред. Долгов В.В., Меньшиков В.В./ – М., ГЭОТАР-Медиа, 2012 – 808 с.
- Практическое руководство по детским болезням. Том 8 Иммунология детского возраста. /Ред. А.Ю.Щербина, Е.Д.Пашанов/ - Москва: МЕДПРАКТИКА, 2006 - 432 с.
- Ройт А., Бростофф Д., Дейл Д. Иммунология. - М.: Мир, 2000 — 592 с
- Ярилин А. А. Иммунология. – М.: ГЭОТАР-Медиа. 2010 - 752 с.
- Leach М., Drummond М., Doig A. Practical Flow Cytometry in Haematology Diagnosis Hardcover. – WILEY-BLACKWELL, 2013.
- Tietz Clinical guide to laboratory tests. 4-th ed. Ed. Wu A.N.B. – USA: W.B Sounders Company, 2006 - 1798 p.
CD4+CD45RA+/CD4+CD45RO+ Определение относительного количества “наивных” CD4+-лимфоцитов, «клеток памяти», а так же их соотношения рекомендуется выполнять при острых и хронических инфекционных заболеваниях.
CD45 – общий лейкоцитарный антиген представлен на поверхности всех лейкоцитов человека. Уровень экспрессии CD45 нарастает по мере дифференцировки гемопоэтических клеток от незрелых предшественников до зрелых форм. Максимальный уровень CD45 представлен на зрелых лимфоцитах. Существует несколько изоформ CD45. Антиген CD45RA экспрессируется на наивных Т-клетках, В-клетках и моноцитах.
CD45RO – экспрессируется на эффекторных Т-клетках, Т-клетках памяти, В-клетках, моноцитах и макрофагах.
Увеличение Т-лимфоцитов хелперов с фенотипом CD4+CD45RO+ (“клетки памяти”) характеризует активный гуморальный ответ на чужеродный антиген в прошлом и потенциальную возможность развития острых воспалительных при повторном контакте с чужеродным антигеном за счет сформированной иммунологической памяти.
Индекс снижается после перенесенного инфекционного заболевания и увеличение его в периоде реконвалесценции говорит о благоприятном течении заболевания. С возрастом индекс снижается за счет увеличения клеток памяти. Показано, что процент “наивных” CD4-лимфоцитов до начала терапии влияет на последующий прирост CD4-лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией. При развитии инфекции, при хирургическом вмешательстве происходит накопление CD4 +CD45RO+ и снижение CD4+CD45RA+.
Функциональные маркеры CD4+/CD4OL+, CD4+/CD28+, CD8+/CD28+, CD8+/CD57+CD4+/CD4OL+ – тест рекомендуется назначать при нарушении гуморального ответа, для диагностики врожденных иммунодефицитов.
CD4OL – ко-стимулятор пролиферации Т-клеток, экспрессируется активированными Т-клетками. Играет центральную роль на различных фазах В-клеточного ответа на Т- зависимые антигены.
Следствием дефицита CD4OL является ослабление активности дендритных клеток, а именно выработки ими ИН12 и интерферона гамма, необходимых для дифференцировки Т-хелперов 1 и реализации воспалительного варианта клеточного иммунного ответа. Снижение относительного количества этих клеток наблюдается при врожденных иммунодефицитах (гипер–IgM-синдроме, который проявляется в ослаблении гуморального иммунитета – функциональная “слабость” IgM- антител), а также клеточного иммунитета. Численность Т- и В-лимфоцитов при этом не изменяется.
Повышение экспрессии CD4OL на Т-хелперах отмечено при хроническом лимфолейкозе и аутоиммунных заболеваниях.
CD4+/CD28+ – отражает относительное содержание Т-хелперов со сниженной функцией клеточной адгезии. Рекомендовано назначать при инфекционных заболеваниях различной этиологии. CD28 экспрессируется на большинстве Т-лимфоцитов (CD4+-клетки до 95%), активированных В-клетках, плазматических клетках. Принимает участи в активации Т-лимфоцитов, является индуктором пролиферации и продукции цитокинов. Котимулирующая молекула, играющая важную роль в иммунном ответе.
Снижение экспрессии CD28 на CD4-лимфоцитах отмечено при вирусных и бактериальных инфекциях различной этиологии, у пожилых.
CD8+/CD28+ – отражает относительное содержание ЦТЛ со сниженной функцией клеточной адгезии. Рекомендовано назначать при инфекционных заболеваниях различной этиологии. CD28 экспрессируется на большинстве Т-лимфоцитов (CD8+-клетки до 50%), активированных В-клетках, плазматических клетках. Принимает участие в активации Т-лимфоцитов, является индуктором пролиферации и продукции цитокинов. Ко-стимулирующая молекула, играющая важную роль в иммунном ответе. Снижение экспрессии CD28 на ЦТ лимфоцитах отмечено при вирусных и бактериальных инфекциях различной этиологии, у пожилых.
CD8+/CD57+ – дополнительный маркер нарушений функционирования иммунной системы при хронических заболеваниях. CD57 экспрессируется на NK-клетках, некоторых Т-лимфоцитах, В-лимфоцитах, моноцитах. Показано, что увеличение экспрессии на ЦТ лимфоцитах замедляет пролиферацию Т-клеток. Увеличение Т-лимфоцитов с фенотипом CD8+CD57+ отмечено при некоторых хронических инфекциях, в частности, при туберкулезе и ВИЧ-инфекции, синдроме Фелти, ТNK- клеточном лейкозе. При благоприятном течении заболевания, в процессе терапии, количество этих клеток нормализуется.
Тест используют при дифференциации нейроэндокринных опухолей. Снижение – при NK-клеточных лимфомах, болезни Лайма.
CD19+/CD5+популяция В-лимфоцитов (В1клетки). Тест рекомендован как дополнительный диагностический маркер при аутоиммунных заболеваниях и мониторинге лечения аутоиммунных заболеваний.
В настоящее время среди В-лимфоцитов выделяют три субпопуляции: В1, В2 и В-клетки памяти. При аутоиммунных заболеваниях В-лимфоциты начинают экспрессировать рецептор СD5. Их называют В1-клетки. В норме этот рецептор экспрессируется на Т-лимфоцитах, В-лимфоцитах до 1,3%, клетками лимфоидной ткани селезенки, вилочковой железы, принимает участие в регуляции пролиферации Т-лимфоцитов. Было выявлено, что В1-популяция увеличивается у пациентов, страдающих аутоиммунным тиреоидитом, СД 1 типа, СКВ, ревматоидным артритом, миастенией, в процессе лечения число этой популяции снижалось до нормальных величин. При пролиферации клонов этих клеток и преобразовании их в плазматические клетки происходит избыточная наработка аутоантител.