Отличается от неспецифической тем, что в этом случае трансдуцирующие фаги всегда переносят только определенные гены, а именно, те из них, которые располагаются в хромосоме лизогенной клетки слева от attL или справа от attR. Специфическая трансдукция всегда связана с интеграцией умеренного фага в хромосому клетки-хозяина. При выходе (исключении) из хромосомы профаг может захватить ген с левого или правого фланга, например или gal, или bio. Но в этом случае он должен лишиться такого же размера своей ДНК с противоположного конца, чтобы ее общая длина оставалась неизменной (иначе она не может быть упакована в головку фага). Поэтому при такой форме исключения обр
Специфическую трансдукцию у E. coli осуществляет не только фаг лямбда, но и родственные ему лямбдоидные и другие фаги. В зависимости от места расположения сайтов attB на хромосоме они при своем исключении могут включать различные бактериальные гены, сцепленные с профагом, и трансдуцировать их в другие клетки. Встраивающийся в геном материал может замещать до 1 / 3 генетического материала фага.
Трансдуцирующий фаг в случае инфицирования реципиентной клетки интегрируется в ее хромосому и привносит в нее новый ген (новый признак), опосредуя не только лизогенизацию, но и лизогенную конверсию.
Таким образом, если при неспецифической трансдукции фаг является только пассивным переносчиком генетического материала, то при специфической фаг включает этот материал в свой геном и передает его, лизогенизируя бактерии, реципиенту. Однако лизогенная конверсия может произойти и в том случае, если геном умеренного фага содержит такие собственные гены, которые у клетки отсутствуют, но отвечают за синтез существенно важных белков. Например, способностью вырабатывать экзотоксин обладают только те возбудители дифтерии, в хромосому которых интегрирован умеренный профаг, несущий оперон tox. Он отвечает за синтез дифтерийного токсина. Иначе говоря, умеренный фаг tox вызывает лизогенную конверсию нетоксигенной дифтерийной палочки в токсигенную.
Метод агаровых слоев заключается в следующем. Вначале в чашку наливают слой питательного агара. После застывания на этот слой добавляют 2 мл расплавленного и охлажденного до 45 °C агара 0,7 %-ного, в который предварительно добавляют каплю концентрированной суспензии бактерий и определенный объем суспензии фага. После того как верхний слой застынет, чашку помещают в термостат. Бактерии размножаются внутри мягкого слоя агара, образуя сплошной непрозрачный фон, на котором хорошо видны колонии фага в виде стерильных пятен (рис. 84, 2). Каждая колония образуется за счет размножения одного исходного фагового вириона. Применение этого метода позволяет: а) путем подсчета колоний точно определить количество жизнеспособных фаговых вирионов в данном материале;
б) по характерным признакам (размер, прозрачность и др.) изучать наследственную изменчивость у фагов.
По спектру своего действия на бактерии фаги подразделяются на поливалентные (лизируют родственные бактерии, например поливалентный сальмонеллезный фаг лизирует почти все сальмонеллы), монофаги (лизируют бактерии только одного вида, например фаг Vi-I лизирует только возбудителей брюшного тифа) и типоспецифические фаги, которые избирательно лизируют отдельные варианты бактерий внутри вида. С помощью таких фагов производится наиболее тонкая дифференциация бактерий внутри вида, с разделением их на фаговарианты. Например, с помощью набора фагов Vi-II возбудитель брюшного тифа делится более чем на 100 фаговариантов. Поскольку чувствительность бактерий к фагам является относительно стабильным признаком, связанным с наличием соответствующих рецепторов, фаготипирование имеет важное диагностическое и эпидемиологическое значение.
В другую бактериофагом . Общая трансдукция используется в генетике бактерий для картирования генома . К трансдукции способны как умеренные фаги, так и вирулентные , последние, однако, уничтожают популяцию бактерий, поэтому трансдукция с их помощью не имеет большого значения ни в природе, ни при проведении исследований.
Трансдукция была описана Нортоном Зиндером и Джошуа Ледербергом в 1952 году у Salmonella . Они наблюдали восстановление нормальных фенотипов у ауксотрофных штаммов , и доказали, что перенос генетического материала мог осуществлять только вирус .
Механизм
Общая схема трансдукции
Трансдукция - это опосредованная фагами передача ДНК между бактериальными клетками. Ключевой этап этого процесса - упаковка переносимой ДНК в головку фага во время литической фазы его жизненного цикла , то есть когда клетка погибает, высвобождая наружу вирусные частицы . Как правило, при сборке вирусных частиц в головку фага попадает его собственная ДНК, но изредка случаются ошибки, когда в головку фага попадают фрагменты бактериальной ДНК, которые могли образоваться, например, при вызванном фагом разрушении бактериальной хромосомы . Фаговые частицы, содержащие фрагменты бактериальной ДНК, называют трансдуцирующими частицами. Они могут заражать клетки как нормальные фаги, так как имеют все необходимые для этого гены . Когда после прикрепления к клетке фаг впрыскивает в неё свою геномную ДНК, он впрыскивает и бактериальную ДНК, содержащуюся в его головке. Любопытно, что трансдукция возможна и во время литического цикла.
К трансдукции способны не все фаги. К ней способны лишь те фаги, которые вызывают фрагментацию бактериальной геномной ДНК на фрагменты нужного размера, чтобы они поместились в капсид . Иногда в вирион попадает не геномная ДНК бактерии, а плазмида , которая после попадания в следующую заражённую клетку продолжит удваиваться. Фрагменты генома, переносимые фагами, напротив, к репликации неспособны ; их удвоение возможно лишь в том случае, если они смогут интегрироваться в хромосому бактерии-реципиента . Если фрагмент бактериального генома так и останется свободным, он в течение нескольких поколений будет попадать в одну из дочерних клеток при делении ; такую трансдукцию называют абортивной .
Видео по теме
Трансдукционное картирование
Трансдукцию применяли для картирования генов бактериальных хромосом. Метод основан на том, что фрагменты бактериальной ДНК, переносимые при трансдукции, достаточно велики и могут содержать целый ряд генов, поэтому близко расположенные гены могут при трансдукции переноситься одновременно (котрансдукция). Чем меньше гены
Трансформация
Трансформацией называется перенос чистой ДНК из одних клеток в другие. Трансформация была открыта бактериологом Ф. Гриффитсом в 1928 г. в опытах с пневмококками. У пневмококков известно два типа штаммов: S– и R–формы.
S–форма характеризуется наличием полисахаридной капсулы, благодаря чему при искусственном культивировании она образует гладкие блестящие колонии; эта форма патогенна для мышей. R–форма не имеет капсулы, при искусственном культивировании она образует шероховатые колонии; эта форма непатогенна для мышей. Но если мышам одновременно ввести убитые S–клетки и живые R–клетки, то мыши погибают. Следовательно, генетические свойства одного штамма влияют на генетические свойства другого штамма.
В 1944 г. О. Эвери, К. МакЛеод и М. МакКарти доказали, что изменение наследственных свойств клеток связано с переносом ДНК.
Способность клетки к трансформации возможна при особом ее состоянии, которое называется компетентностью. У компетентных клеток изменяется состав клеточной стенки и плазмалеммы: стенка становится пористой, плазмалемма образует многочисленные впячивания, а на внешней поверхности появляются особые антигены – факторы компетентности (в частности, специфические белки с низкой молекулярной массой).
В природных условиях внеклеточная чистая ДНК образуется при гибели (лизисе) прокариот.
Как правило, трансформация происходит в пределах одного вида прокариот, но при наличии гомологичных генов наблюдается и межвидовая трансформация.
Процесс трансформации включает следующие стадии:
1. Присоединение трансформирующей двунитевой ДНК к рецепторам на поверхности клетки–реципиента.
2. Превращение двунитевой ДНК в однонитевую.
3. Проникновение однонитевой ДНК в клетку.
4. Интеграция трансформирующей ДНК в хромосому реципиента и рекомбинация генетического материала.
Длина трансформирующей ДНК должна быть от 500 до 200 тысяч пн. Энергия, выделяющаяся при деградации одной из нитей ДНК, используется для активного транспорта оставшейся нити вовнутрь клетки.
Первые три стадии трансформации не зависят от нуклеотидного состава ДНК. Однако процесс интеграции трансформирующей ДНК в хромосому реципиента более вероятен при высокой гомологичности этой ДНК по отношению к ДНК реципиента.
Процесс трансформации изображен на схеме. Каждый отрезок прямой соответствует одной цепи ДНК. Трансформирующая ДНК обозначена черным цветом, а ДНК клетки–реципиента – серым цветом.
На первой стадии трансформирующая ДНК присоединяется к рецепторным сайтам на поверхности клетки–реципиента.
На втором этапе двунитевая ДНК на поверхности клетки превращается в однонитевую за счет расщепления одной из нитей бактериальными нуклеазами.
На третьем этапе оставшаяся нить ДНК транспортируется через мембрану в цитоплазму. При этом используется энергия, выделившаяся при деградации комплементарной цепи.
При репликации бактериальной хромосомы трансформирующая нить ДНК присоединяется к гомологичному (частично комплементарному) участку ДНК клетки–реципиента. При этом из-за отсутствия полной комплементарности образуется гетеродуплекс («молекулярная гетерозигота») – участок двунитевой ДНК, на котором не во всех нуклеотидных парах азотистые основания связаны водородными связями. Остальная часть ДНК реплицируется нормальным образом.
После окончания репликации ДНК клетка–реципиент делится с образованием двух клеток: частично трансформированной клетки с хромосомой, включающей гетеродуплексный участок ДНК, и нетрансформированной клетки. При репликации ДНК в частично трансформированной клетке на обеих цепях ДНК происходит достраивание комплементарных цепей. Одна цепь сохраняет исходные последовательности нуклеотидов, а другая становится полностью трансформированной. После деления частично трансформированной клетки образуется одна нетрансформированная клетка и одна полностью трансформированная, у которой исходная последовательность нуклеотидов замещена на последовательность нуклеотидов трансформирующей ДНК.
Таким образом, при трансформации происходит не добавление новых генов, а замещение генов реципиента на гомологичные нуклеотидные последовательности.
Частота трансформации у прокариот зависит от свойств трансформирующей ДНК, от ее концентрации, от состояния клетки–реципиента, от вида бактерий. Максимальная частота трансформированных клеток не превышает 1 на 100 клеток.
Трансформация известна и для эукариот. Однако на поверхности эукариотических клеток отсутствуют рецепторные сайты, и трансформирующую ДНК вводят в клетки искусственно. Например, в яйцеклетки животных ДНК вводят путем прямой микроинъекции, а в яйцеклетки растений – путем микроинъекции в пыльцевую трубку.
Трансдукцией называется перенос генетического материала с помощью вирусов из клетки-донора в клетку-реципиент.
Явление трансдукции открыл в 1951 г. Н. Зиндер (ученик Дж. Ледерберга).
При трансдукции в вирионы попадает ДНК клетки-хозяина. Вирионы заражают другие клетки, и ДНК исходной бактериальной клетки проникает в другую бактериальную клетку. Вирусная ДНК интегрируется в бактериальную хромосому, а привнесенная бактериальная ДНК рекомбинирует с ДНК бактериальной хромосомы. В результате 50% клеток оказываются трансформированными.
Различают общую (неспецифическую), ограниченную (специфическую) и абортивную трансдукцию.
Общая трансдукция
При общей трансдукции фрагменты бактериальной ДНК донора случайно включаются в созревающую фаговую частицу вместе с фаговой ДНК или вместо фаговой ДНК. Фрагменты бактериальной ДНК образуются при ее разрезании ферментом, контролируемым фагом. В состав фаговой частицы может включаться до 100 бактериальных генов.
Ограниченная трансдукция
При ограниченной трансдукции происходит рекомбинация – бактериальная ДНК замещает часть фаговой ДНК. В состав рекомбинантной ДНК входит небольшое количество бактериальных генов, прилежащих к фаговой ДНК, интегрированной в бактериальную хромосому.
При общей и ограниченной трансдукции донорская ДНК замещает гомологичные участки ДНК реципиента. Этот процесс сходен с трансформацией.
Абортивная трансдукция может быть и неспецифической, и специфической. Ее сущность заключается в том, что трансдуцируемый фагом фрагмент ДНК не включается в хромосому реципиента, а существует как цитоплазматический репликон. Рано или поздно этот репликон утрачивается.
Явление трансдукции вирусами широко используется при переносе генов у эукариот. Если применяется вирус, неспособный формировать капсид (то есть существующий только в форме ДНК), то трансдукция принципиально не отличается от трансформации или от конъюгативного переноса генетического материала с помощью плазмид–векторов. Созданы системы векторов на основе модифицированных вирусов SV40 (они образуют в клетке до 100 тысяч копий), герпеса, осповакцины, вирус мозаики цветной капусты.
Следует еще раз подчеркнуть, что все описанные типы рекомбинации связаны не с добавлением новых участков ДНК, а с замещением уже имеющихся нуклеотидных последовательностей. Чем выше степень гомологии трансформирующей и исходной ДНК, тем выше вероятность успешной рекомбинации. Легче всего удается рекомбинация ферментов, имеющихся у всех организмов. Труднее ввести в геном новые регуляторы, отличающиеся высокой специфичностью. Поэтому для внедрения в геном новых генов используются более сложные методы, связанные с биохимическими модификациями ДНК.
При общей трансдукции фаговые частицы, содержащие сегменты ДНК клетки-хозяина, переносят относительно протяженные участки геномной ДНК от одной бактериальной клетки к другой. Трансдуцирующие фаговые частицы образуются в ходе определенных инфекционных процессов, когда ДНК клетки эффективно деградирует и фрагменты
клеточной ДНК, по размеру примерно соответствующие фаговому геному, случайно упаковываются в зрелые частицы бактериофага. В результате последующего инфицирования клеток бактерий популяцией фаговых частиц, содержащих в том числе и трандуцирующие фаги, с помощью последних происходит передача ДНК донорных клеток этим инфицируемым клеткам. Рекомбинация между введенными фрагментами донорной ДНК и ДНК клетки-реципиента приводит к изменению генотипа последней.
Каждая трансдуцирующая фаговая частица обычно содержит только один случайный фрагмент исходной донорной хромосомы. Вероятность включения в такую частицу любой части донорного генома примерно одинакова. Однако благодаря довольно большому размеру трансдуцируемых сегментов ДНК (для определенных бактериофагов он составляет около 100 т.п.н., или 2,5 процента всей хромосомы кишечной палочки) обычно реципиентная клетка приобретает за один акт трансдукции целую группу генов. В результате гены, тесно сцепленные друг с другом в хромосоме донора, с высокой частотой котрансдуцируются, тогда как гены, удаленные друг от друга, транс дуцируются независимо. Определение частоты котрансдукции генов помогает уточнить генетические карты, позволяя оценивать относительные расстояния между тесно сцепленными генами. 3 Специфическая (ограниченная) трансдукция
Трансдукция второго типа, специфическая, свойственна умеренным бактериофагам, инфекционный цикл которых прерывается в результате включения генома вируса в специфический хромосомный локус ДНК инфицированной клетки. Бактерии, содержащие такие интегрированные фаговые геномы, получили название лизогенных. Они несут вирусные геномы как наследственные элементы собственных хромосом. В лизогенной клетке вирусные и клеточные геномы реплицируются как единое целое и являются взаимно совместимыми. Интеграция фагового генома с геномом клетки-хозяина лишает фаг возможности вызывать гибель клетки и продуцировать инфекционное потомство. По этой причине бактериофаг,
способный лизогенезировать, в отличие от вирулентного фага, получил название умеренного.
При определенных условиях - индукции - лизогенное состояние прерывается и вирусный геном вырезается из хромосомы ютетки-хозяина. Он реплицируется, образуя множество вирусных частиц, и убивает клетку. Обычно вырезание вирусного генома происходит очень точно и образующийся фаг содержит вирусный геном, полностью соответствующий исходному.
Иногда фаговый геном вырезается неправильно и в дочерние фаговые частицы включаются хромосомные гены, прилегающие к интегрированному вирусному геному. Эти гены включаются вместо некоторых вирусных генов. Во время следующего цикла инфекции гены клетки-донора переходят вместе с фаговыми генами в реципиентные клетки. После включения ДНК трансдуцирующего фага в геном реципиента клетка приобретает наряду с фаговым геномом генетическую информацию предыдущего хозяина фага.
Таким образом, при специфической трансдукции фаг служит вектором для переноса генов от одной клетки в другую. С помощью этого механизма трансдуцируются только те хромосомные гены клетки-хозяина, которые тесно сцеплены с сайтом интеграции вирусного генома.
Поскольку различные умеренные фаги встраиваются в разные хромосомные сайты, при их неправильном вырезании образуются фаги, которые трансдуцируют разные хромосомные гены. Так фаги лямбда трансдуцируют гены, ответственные за метаболизм галактозы, или гены, контролирующие синтез биотина, а фаги ф80 - различное число генов, кодирующих ферменты биосинтеза триптофана.
Фаговый геном способен к специфической трансдукции при условии:
1 Он должен приобрести ковалентно сцепленный сегмент невирусной ДНК, который будет трансдуцироваться. Этот сегмент ДНК обычно имеет клеточное происхождение, но в принципе он может быть из любого источника. Он может включаться в любое место вирусного генома, если это
не влияет на репликацию вирусной ДНК в инфицированной клетке хозяина или на её способность упаковываться в зрелые фаговые частицы.
2 Фаговый геном должен быть способен реплицироваться после того, как произошло инфицирование реципиентной клетки, т.е. в вирусной ДНК должны сохраняться область начала репликации (оп) и гены, необходимые для осуществления репликации.
3 Фаговые гены, кодирующие структурные фаговые белки, должны быть функционально активными.
Специфическая трансдукция широко используется в молекулярной генетике. Рассмотрим один из примеров такого применения данного явления. Ген кишечной палочки, кодирующий синтез фермента бета-галактозидазы, содержит 3600 п.н. и составляет одну тысячную генома данного микроорганизма. Если фрагмент ДНК бактериальной клетки, кодирующий синтез бета-галактозидазы, встраивается в геном трансдуцирующего бактериофага лямбда, он занимает там одну пятнадцатую часть, то есть ДНК фага лямбда обогащена бета-галактозидазным геном в 100 раз больше, чем ДНК кишечной палочки.
Изучение явления трансформации послужило толчком к открытию другого явления - трансдукции - переноса и рекомбинации генов у бактерий с помощью бактериофага.
Опыт, позволивший открыть этот новый генетический механизм и новый способ изучения наследственности, заключается в следующем.
U-образная трубка в нижней части была разделена посредине бактериальным фильтром. В одну половину этой трубки были помещены тифозные бактерии (Salmonella typhimurium) штамма 22А, а в другую половину трубки - штамма 2А. При этом бактериальные клетки не могли переходить сквозь перегородку.
Штамм 22А нес мутацию, блокирующую синтез триптофана Т — , и поэтому при культивировании бактерии нуждались в добавке триптофана в среду. Штамм бактерии 2А имел мутацию, блокирующую синтез гистидина Н — , и поэтому нуждался в нем при культивировании.
После инкубации этих двух разных штаммов в трубке, разделенной только бактериальным фильтром, был произведен рассев клеток обоих штаммов. При рассеве клеток штамма 22А на среде, лишенной триптофана, было обнаружено небольшое число колоний. Следовательно, некоторые клетки штамма 22А каким-то образом приобрели способность синтезировать триптофан и смогли дать колонии на среде без этой аминокислоты. Частота появления таких клеток была равна 1х10 -5 .
Можно было предположить, что эти измененные клетки что явились или в результате обратной мутации от Т — к Т + или перехода трансформирующего фактора от штамма 2А. Но штамм 22А отличался высокой стабильностью, и поэтому указанную частоту появления (10 6) клеток генотипа Т + нельзя было объяснить возникновением обратных мутаций. Трансформирующий фактор в среде также не был обнаружен. Фильтрующимся агентом, переносящим ген Т + от штамма 2А к штамму 22А, оказался бактериофаг.
Таковы первые факты, доказавшие передачу наследственной информации с помощью бактериофага от бактерии одного генотипа к бактерии другого генотипа. Это открытие было сделано в 1952 г. Н. Циндером и Дж. Ледербергом.
Используемый в исследованиях Циндера и Ледерберга штамм 22A Solmonella typhirnurium не обладал способностью синтезировать триптофан, но после совместного содержания в разделенной фильтром U-образной трубке со штаммом 2А приобрел свойство синтезировать триптофан. Это могло произойти только в том случае, если фаг, вышедший из клеток штамма 2А, проник через фильтр, внедрился в некоторые клетки штамма 22А и передал им часть наследственной информации - фрагмент наследственного материала штамма 2А.
Следовательно, ДНК фага, лизогенизирующего бактерию, каким — то образом претерпевает рекомбинацию с ДНК бактериальной клетки, в силу чего в новые фаговые частицы включаются гены клетки-хозяина. Эти фаги, заражая вновь клетки другого генотипа, также передают ей свою ДНК с новой информацией. Так, клетки штамма 22А приобрели ген, ответственный за синтез триптофана.
Как мы видели, фаги являются переносчиками наследственной информации от бактерии одного генотипа к бактерии другого генотипа. И это возможно только при условии, если ДНК фага вступает интимные связи с ДНК хромосом бактериальных клеток. Это явление переноса отдельных наследственных задатков от бактерии-донора, в которой происходили размножение фага и рекомбинация Готического материала фага и хозяина-бактерии к реципиенту, и называется трансдукцией .
Донором является культура бактерии, способная синтезировать метионин М + и ферментировать галактозу Gal + , а также имеющая стрептомициноустойчивость Sm r . Бактерия-реципиент не синтезирует метионин М — , не сбраживает галактозу Gal — и чувствительна к стрептомицину Sm s . Фаголизат, полученный от донора M + Gal + Sm r , вносят в культуру реципиента M — Gal — Sm s . После инкубации клетки реципиента рассевают на соответствующих селективных средах, в результате чего обнаруживаются три новых класса рекомбинантов M — Gal + Sm s , M + Gal — Sm S , M — Gal — Sm r .
В случае трансдукции донор через фаг передает лишь отдельный фрагмент ДНК. Поэтому инфицированные бактерии реципиента являются как бы диплоидными по переданному фрагменту (мерозиготы) и частично гетерозиготами (гетерогеноты), в потомстве которых могут быть рекомбинантные бактерии M + Gal — Sm s и M — Gal — Sm s возникшие при трансдукции.
Судьба переданного фрагмента хромосомы донора в клетке реципиента может быть различной. Этот фрагмент может, во-первых, внедриться в хромосому хозяина и реплицироваться совместно и синхронно с соответствующим участком хромосомы хозяина (завершенная трансдукция), во-вторых, может быть удален из клетки хозяина и, в-третьих, может сохранять автономность и передаваться от клетки к клетке независимо от хромосомы хозяина (абортивная трансдукция).
Фаг может переносить самые различные гены бактерий, обусловливающие определенный характер синтеза аминокислот, различные ферментативные свойства, устойчивость к антибиотикам (стрептомицину, пенициллину) и иммунность к другому фагу. Как правило, одновременно трансдуцируется один, реже - два тесно сцепленных гена и очень редко три гена. Эта особенность была использована в опытах М. Демереца с сотрудниками, которым удалось посредством учета результатов трансдукции провести картирование тесно сцепленных генных локусов, обеспечивающих синтез цистеина у Salmonella.
Таким образом, трансдукция так же, как и трансформация, является своеобразным процессом рекомбинации генов. Рекомбинация генов является одним из механизмов, осуществляющих у бактерий комбинативную изменчивость, которая у высших организмов обеспечивается мейозом.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .